Regulation of OCT4-PP1 axis for targeting cancer stemness

Abstract

OCT4 (encoded by POU5f1) is a master regulator of pluripotency and closely related to tumor malignancies. Its associations with cancer drug-resistance, recurrence and poor prognosis of the patients have been widely reported. As OCT4 transcriptional activity is directly and indirectly involved in the maintenance of cancer stemness, inhibition of OCT4 activity could be a strategy to reduced cancer malignancies by eliminating stemness. In this study, we investigated a way to regulate the stemness of germ cell tumors (GCTs) by perturbation of posttranslational modification of OCT4. First, to confirm the role of OCT4 in the maintenance of stemness in tumor, we generated the cells, in which OCT4 is downregulated doxycycline-dependently. Downregulation of OCT4 caused weaker alkaline phosphates staining, reduced tumor sphere formation, and reduced expression of stemness marker proteins. Also, the cells underwent retardation of proliferation, cell-cycle arrest in G1 phase, and eventual apoptosis. Most of germ cell tumor specific OCT4 direct target genes were grouped into the category of extracellular matrix (ECM). Second, to regulate OCT4 transcriptional activity, we used phosphorylation of serine 236th (S236) residue on OCT4. Germs cells tumor cells, with which their endogenous OCT4 was substituted with an OCT4 phosphorylation-mimicking mutant (Serine 236 to aspartate; S236D), showed similar phenotype to those cells that were depleted in OCT4. Chemical inhibition or knockdown of PP1 (protein phosphatase 1), which remove the phosphorylation, induced accumulation of S236 phosphorylation, and also caused similar phenotype to those cells that were depleted in OCT4. Moreover, in the mouse xenograft model, OCT4-S236D caused tumor growth inhibition and differentiation of undifferentiated germ cell tumor cells to various types of differentiated cell. Finally, to evaluate whether regulation of OCT4 can reduce tumor malignancy, we tested whether drug-tolerant persister cancer cells could be reduced by regulation of OCT4. Inhibition of PP1 along with cisplatin treatment significantly reduced drug-resistant colonies compared with single treatment of cisplatin. These results suggested that stemness of germ cell tumor could be regulated by OCT4 posttranslational modifications and regulation of cancer stemness could reduce tumor malignancy.;OCT4 (POU5F1 유전자에 암호화된 단백질)는 종양의 악성화와 밀접한 관련이 있는 조절인자이다. OCT4 전사 활성은 암 줄기세포성의 유지에 직∙간접적으로 관여하고 있으며, 최근 OCT4와 항암제 내성, 암 재발 및 환자의 불량한 예후와의 관련성이 널리 보고되고 있다. OCT4의 전사활성을 조절할 수 있는 방법을 찾는다면, 암 줄기세포성을 표적함으로써 악성 종양을 감소시키는 효과적인 전략으로 이용할 수 있다. 본 연구에서 OCT4의 번역 후 변형과정을 이용하여 생식세포암의 줄기세포성을 조절하는 방법을 조사하였다. 첫째, OCT4 저해를 통해 생식세포암의 생장과 암 줄기세포성 유지에 OCT4의 핵심적인 역할을 발견했다. 독시사이클린에 의존적으로 shRNA가 발현되어 OCT4를 저해하는 세포를 제작했다. OCT4의 저해는 줄기세포성 염색, 종양 구형 형성 감소 및 줄기세포성 관련 단백질의 발현 감소를 초래했다. 또한, G0/G1 기에서의 세포주기 정지를 비롯한 세포 증식의 지연 및 OCT4 저해로 인한 궁극적인 세포 사멸로 이어졌다. 생식세포암에서 OC4에 의해 직접적으로 조절되는 유전자는 세포외기질과 관련이 있는 유전자였다. 이는 배아줄기세포와 비교하여 암에서 특징적으로 발견되었다. 둘째, OCT4의 236번째 아미노산에 해당하는 세린의 인산화를 통해 OCT4의 전사 활성 조절이 가능함을 발견했다. 내인성 OCT4 대신 236번째 세린 인산화 모방 돌연변이 OCT4 (세린을 아스파테이트로 대체한 형태)로 치환된 종양 세포는 OCT4를 저해한 세포와 유사한 표현형을 나타내었다. 인산화를 제거하는 PP1 (단백질 포스파타아제1)의 화학적 억제 또는 하향조절은 S236 인산화의 축적을 유발하였고 OCT4가 저해된 세포와 유사한 표현형을 보였다. 또한, 마우스 이종 이식 모델 에서 인산화 모방 돌연변이 OCT4로의 치환에 의해 종양은 성장이 억제되고 종양의 구성 조직은 다양하게 분화되어 여러 조직세포 유형이 관찰되었다. 마지막으로, 약물 내성 암세포가 OCT4의 조절에 의해 감소 됨을 발견하였다. 시스플라틴을 처리하여도 일부 세포는 저항성 가지고 살아남아 생장함을 확인하였다. 시스플라틴 처리와 동시에 PP1의 억제는 시스플라틴의 단일 처리와 비교하여 약물 내성 세포의 수를 유의하게 감소시켰다. 이러한 결과는 암의 줄기세포성이 OCT4 번역 후 변형에 의해 조절 될 수 있고 암 줄기의 조절이 악성 종양을 감소시킬 수 있다고 제안한다.