Effect of α, β methylene ATP or oral P. gingivalis infection on atherosclerosis

Abstract

[Part 1] Obesity is a worldwide medical concern associated with having an excess amount of body fat. Obesity is known to cause metabolic diseases including atherosclerosis and diabetes. However, it is not clear how pathologic mechanisms of distinct metabolic diseases related to obesity are linked. Atherosclerosis, a chronic disease that the gradual formation of plaque in the arterial intima. Atherosclerosis is caused by many factors including obesity, tobacco smoking, and diabetes, and is the major pathology for cardiovascular diseases, the leading cause of deaths worldwide. Despite many researches for developing new therapy, the treatment of atherosclerosis has been limited. Extracellular ATP plays various functions as a signaling molecule through variety of purinergic receptors. There have been many reports revealing various effects of ATP on atherosclerosis and lipid metabolism. Since the signals triggered by ATP are redundant and complex, contrary effects of ATP on metabolic disorders have been reported. In the thesis, we evaluated effects of α, β-methylene ATP, a phosphonic analog of ATP. We found that different doses of ATP (2.5 and 10nmol) show distinct effects on atherosclerotic lesion development and lipid metabolism. Intra-peritoneal administration of low dose (2.5nmol) of α, β-methylene ATP moderated atherosclerotic lesions in the aortae of the ApoE-/- mice and increased serum adiponectin and HDL concentrations. AAdministration of 2.5nmol of α, β-methylene ATP aggravated insulin tolerance in ApoE- /- mice. White adipose tissues (WAT) of the 10nmol α, β-methylene ATP-injected ApoE-/- mice were smaller than that of the control group. And sizes of adipocytes in the 10nmol α, β-methylene ATP-injected mice are smaller than that in the other groups of mice. ATP- injected mice show more fatty infiltrations in livers. Western blot analyses of tissue lysates showed that phosphorylated 5' AMP-activated protein kinase (p-AMPKα) and glucose transporter 4 type 4 (GLUT4) expression were higher in the livers of 2.5nmol ATP-injected group than the other groups. In WAT lysates, p-AMPKα was decreased in 10nmol ATP- injected group and the levels of p-p38 MAPK and GLUT4 expression were increased in 2.5nmol ATP-injected group. PPARα was decreased in the 2.5nmol ATP-injected group. Therefore, the effects of α, β-methylene ATP on metabolic disorders are not simply defined and the contrary consequences of α, β-methylene ATP on progression of atherosclerosis and insulin tolerance suggest that pathologies of these distinct metabolic diseases related to obesity may be distinct in metabolic aspects.BCA1 is increased in liver and aortic arches of low dose α, β-methylene ATP injected mice. [Part 2] Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) is a gram-negative anaerobic bacterium belonging to the Bacteroidetes phylum. It is an important pathogen associated with chronic periodontitis. Recent researches have shown that the increase in pro-inflammatory cytokine in periodontitis causes intestinal dysbiosis and there have been increasing evidences for the association between intestinal dysbiosis and atherosclerosis. The prevalence of atherosclerosis in patients with periodontitis is higher than in healthy individuals. However, the mechanism by which P. gingivalis promotes atherosclerosis and the mechanism of how the oral P. gingivalis infection affects intestinal microbiota have not been clearly defined. We examined the consequences of P. gingivalis infection by inoculating P. gingivalis (109 CFU, daily administration for 3 weeks) into oral cavities of ApoE-/- mice after 8 weeks of WD and maintaining 4 weeks of WD thereafter. Serum analyses for lipids showed that total cholesterol and HDL were lower in ApoE-/- mice with oral P. gingivalis infection and the Oil-red-O staining of the en face aortae of the mice revealed that ApoE-/- mice with oral P. gingivalis infection had larger atherosclerotic lesions. We collected feces from the WD- fed ApoE-/- mice with or without oral P. gingivalis inoculation and analyzed the intestinal microbiota using 16S rRNA gene-based microbiome taxonomic profiling program in the Ezbiocloud. The alpha diversities in the microbiome were analyzed by using CL communityTM version 3.43 (Chunlab, Inc.). The results showed that oral P. gingivalis infection attenuates the WD-induced increase of Firmicutes, however, the relative abundance of Bacteroidetes was not affected by P. gingivalis inoculation. P. gingivalis infection augmented the WD-induced increase in Deferrebacteres. Microbiome alpha diversities (ACE and Chao) were decreased just after the 3-week administration of P. gingivalis (at week 11) and recovered to be similar to ApoE-/- mice without infection after 4 weeks. P. gingivalis oral inoculation significantly changed intestinal microbiota and exacerbated atherosclerosis. Future studies would be warranted to unveil the mechanisms by which P. gingivalis infection alters the microbiota and of how the P. gingivalis infection promotes atherosclerosis.;[Part 1] 비만은 과도한 양의 체지방과 관련된 전 세계적인 의학적 관심사다. 비만은 동맥경화증과 당뇨병을 포함한 대사성 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 그러나 비만과 관련된 대사질환의 병리학적 메커니즘이 어떻게 연관되어 있는지는 명확하지 않다. 동맥경화증은 동맥내부에 동맥경화반이 점진적으로 형성되는 것이 특징인 염증성 질환이다. 동맥경화증은 비만, 흡연, 당뇨병 등 여러 요인에 의해 발생하며, 심혈관 질환의 주요 병리학으로 전 세계적으로 사망의 주요 원인이 되고 있다. 새로운 치료법을 개발하기 위한 많은 연구에도 불구하고, 동맥경화증의 치료는 제한되어 왔다. 세포외 ATP 는 다양한 수용체를 통해 신호 분자로서 다양한 기능을 수행한다. ATP 가 동맥경화증과 지질대사에 미치는 다양한 영향을 드러내는보고가 많았다. ATP 에 의해 촉발된 신호는 복잡하기 때문에 ATP 가 대사 장애에 미치는 다양한 효과가 보고되고 있다. 논문에서는 ATP 의 아날로그인 α, β-메틸렌 ATP 의 효과를 평가하였다. 우리는 서로 다른 농도의 ATP 가 동맥경화성 병변 발생과 지질대사에 뚜렷한 영향을 미친다는 것을 발견했다. 저농도 α,β-메틸렌 ATP 의 복강 내 투여로 아포이 유전자 제거 생쥐의 대동맥 내 동맥 경화성 병변이 감소하고 혈청 아디포넥틴과 HDL 농도가 증가하였다. α, β-메틸렌 ATP 의 저농도 투여는 아포이 유전자 제거 생쥐의 인슐린 저항성을 악화시켰다. 따라서 대사 장애에 대한 α, β-메틸렌 ATP 의 영향은 단순히 정의되지 않으며, 동맥경화증 및 인슐린 저항성의 진행에 대한 α, β-메틸렌 ATP 의 상반된 효과는 비만에 관련된 이러한 뚜렷한 대사 질환의 병리기전이 대사 과정의 다른 경로를 거칠 수 있다는 사실을 시사한다. [Part 2] 포르피로모나스 진지발리스 (P.진지발리스)는 그램 음성 혐기성 박테리아로 Bacteroidetes 속에 속한다. P.진지발리스는 만성 치주염과 관련된 중요한 병원체다. 최근 연구결과 치주염에서 염증성 사이토카인이 증가하면 장내 세균 총의 변화가 발생하며 장내 세균 총 변화와 동맥경화증 사이의 연관성에 대한 증거가 증가하고 있는 것으로 나타났다. 치주염 환자의 동맥경화증 유병률은 건강한 개인보다 높다. 그러나 P.진지발리스 가 동맥경화를 촉진하는 메커니즘과 구강 P.진지발리스 감염이 장내 미생물 군에 어떤 영향을 미치는지에 대한 메커니즘은 명확하게 정의되지 않았다. 콜레스테롤 함유 식이요법 8 주 후 아포이 유전자 제거 생쥐의 구강에 P.진지발리스 (109 CFU, 3 주간 매일 투여) 를 접종하고 이후 4 주간 콜레스테롤 함유 식이요법을 유지하여 P.진지발리스 감염의 영향을 조사하였다. 지질에 대한 혈청 분석 결과 경구 P.진지발리스 감염된 아포이 유전자 제거 생쥐에서 총 콜레스테롤과 고밀도지질단백질이 낮았으며, 경구 P.진지발리스 감염이 있는 아포이 유전자 제거 생쥐의 대동맥에 Oil-Red-O 염색을 통해 동맥경화병변이 더 큰 것을 확인하였다. 우리는 구강 P.진지발리스 감염 여부를 불문하고 콜레스테롤 함유 식단을 섭취하는 아포이 유전자 제거 생쥐로부터 대변을 수집하고, Ezbiocloud 의 16S rRNA 유전자 기반 마이크로바이옴 분류학 프로파일링 프로그램을 이용하여 장내 마이크로바이옴을 분석하였다. 마이크로바이옴의 알파 다양성은 CL communityTM 버전 3.43 (Chunlab, Inc.)을 사용하여 분석하였다. 그 결과 경구 P.진지발리스 감염은 콜레스테롤 함유 식이요법에 의한 Firmicutes 의 증가를 약화시키지만, Bacteroidetes 의 장내세균총내 비율은 P.진지발리스 감염의 영향을 받지 않았다. P.진지발리스 감염은 콜레스테롤 함유 식이요법에 의해 유발된 Deferrebacteres 의 증가를 증가시켰다. 마이크로바이옴 알파 다양성(ACE, Chao)은 P.진지발리스 3 주(11 주) 투여 직후 감소했다가 4 주 만에 감염이 없는 아포이 유전자 제거 생쥐와 비슷한 수준으로 회복됐다. P.진지발리스 경구 투여는 장내 미생물 군을 크게 변화시켰고 동맥경화를 악화시켰다. 향후 P.진지발리스 감염이 마이크로바이옴을 변화시키는 메커니즘과 P.진지발리스 감염이 어떻게 동맥경화를 촉진하는지에 대한 메커니즘을 밝히는 연구가 필요하다.