Study of cytological assessment as a novel endpoint for in vitro skin irritation test and evaluation of skin toxicity with alternative animal test methods

Abstract

OECD guidelines for skin toxicity have been developed relatively lately, and many studies using them have not been reported. Especially, permanent oxidative hair dyes are widely used but their toxicity is not established well. Here we tried to assess the skin sensitization and irritation of nine hair dye substances (MAP, MRP-N, RS, PAOX, 2,4-DAPE, 2,6-PYR, PPD, Grey HED and PM) permitted for use in EU and Korea, using in silico, in chemico and in vitro test methods. Skin sensitization was evaluated by the DEREK, Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) and KeratinoSensTM. Six of nine hair dyes tested were commonly determined as sensitizers. However, the decision for MAP, RS or PAOX was diverged across assays showing 2 positives and 1 negative. Skin irritation of hair dyes was evaluated with or without 6% hydrogen peroxide (H2O2) on a reconstructed human epidermis (RhE), which showed that H2O2 increased the skin irritation potential of some hair dyes. PPD and PM were determined to be irritants with H2O2. Epidermal damages by hair dye and H2O2 could be further confirmed through the histology of tissue remaining after MTT assay. Overall, our study showed that hair dyes have skin sensitization and irritation issues which could be further exacerbated by H2O2. In alternative test methods related to skin toxicity, the skin sensitization can be evaluated in various way. However, skin irritation tests using a RhE model classify skin irritancy of test chemicals based on the tissue-viability value measured with a colorimetric assay. However, color interference from test chemicals or borderline results is often problematic. Here, we examined whether cytology of the cells isolated from treated RhE could be used to determine skin irritancy in comparison with the histology of the treated tissue. First, we evaluated the skin irritancy of 6 chemicals (3 known irritants; DnP, 1-B and PH and 3 known non-irritants; DP, APA and HS) which includes borderline chemicals, with a RhE, Keraskin™. DP, HS, and PH were clearly and correctly classified with viability value, but DnP, 1-B, and APA were often falsely determined, which were attributable to borderline viability values falling near the cutoff, 50%. In histology, the tissues treated with DnP, 1-B, and PH showed the erosion of stratum corneum, vacuolization, and necrosis in the basal layer. Those with DP and HS showed relatively normal morphology but APA induced necrosis similar to irritants. In cytology revealed that DnP, 1-B or PH depleted cells and induced very irregular and abnormal cell shapes. In contrast, those treated with DP, APA or HS showed relatively regular and normal cell shapes and the distinction between the nucleus and cytoplasm was clear. To further confirm the utility of cytology, additional 10 substances, which include false positives in OECD TG 439, were tested and compared. For all test substances (16 in total), cytology: total area predicted the skin irritancy with the highest accuracy (87.5%) followed by cytology: cell count (81.3%), histology (75%) and viability (68.8%), suggesting that cytology can be a good alternative parameter to viability in the skin irritation test in RhE.;피부 독성에 대한 OECD 가이드라인은 비교적 최근에 개발되어, 이를 활용한 연구는 많이 보고되어 있지 않다. 특히 영구적 산화성 염모제는 널리 사용되고 있으나, 그 독성은 잘 확립되어 있지 않다. 따라서 EU 및 대한민국에서 허용된 염모제 9 종(MAP, MRP-N, RS, PAOX, 2,4-DAPE, 2,6-PYR, PPD, Gray HED, PM)의 피부 감작성 및 자극성을 동물대체시험법을 활용하여 평가하고자 하였다. 피부 감작성을 DEREK, DPRA, KeratinoSensTM으로 평가하였다. 시험된 9 종 중 6 종이 공통적으로 감작제인 것으로 결정되었다. 그러나 MAP, RS, PAOX의 경우에는 3 개 시험법에서 양성 2 개 및 음성 1 개로 판정되었다. 염모제의 피부 자극성은 재구성된 인체표피모델(RhE)인 EpidermTM에서 6% H2O2 유무에 따라 평가되었으며, H2O2가 일부 염모제의 피부 자극성을 증가시켰음이 입증되었다. 특히 PPD 및 PM은 H2O2 존재 하에 자극제인 것으로 결정되었다. 염모제 및 H2O2에 의한 표피 손상은 시험물질이 처리된 조직의 병리를 통하여 추가로 확인되었다. 종합적으로, 염모제가 피부 감작 및 자극 가능성이 있으며, 이는 H2O2에 의하여 더욱 악화될 수 있음이 입증되었다. 피부 독성과 관련된 동물대체시험법에서, 피부 감작성은 다양한 방법으로 평가될 수 있다. 그러나 RhE 모델을 사용한 피부자극시험은 비색분석으로 측정된 조직 생존율 값을 기반으로만 시험물질의 피부 자극성을 결정한다. 그러나 자극제를 분류하는 데 있어, 시험물질의 색 간섭 또는 경계선상의 결과는 문제의 여지가 있다. 처리된 RhE에서 분리된 세포의 세포학이 조직학과 비교하여 피부 자극성을 결정하는 데 활용할 수 있는지 조사하였다. 먼저, 경계선상의 화학물질을 포함하는 시험물질 6 종(자극제로 알려진 3 종; DnP, 1-B, PH 및 비자극제로 알려진 3 종; DP, APA, HS)의 피부 자극성을 RhE인 KeraskinTM에서 평가하였다. DP, HS, PH는 생존율 값으로 정확하게 분류되었으나, DnP, 1-B, APA는 경우에 따라 잘못 결정되었는데, 이는 생존율 값이 컷-오프(50%) 근처에 존재하기 때문이다. 조직학 결과, DnP, 1-B, PH로 처리된 조직에서 각질층의 미란, 기저층의 액포화 및 괴사가 나타났다. DP 및 HS가 처리된 조직에서는 비교적 정상적인 형태가 관찰되었으나, APA는 자극제와 유사한 괴사를 유발시켰다. 세포학 결과, DnP, 1-B, PH는 세포 수를 감소시켰고, 매우 불규칙하고 비정상적인 세포 형태를 유도하였다. 대조적으로, DP, APA, HS가 처리된 조직에서는 비교적 규칙적이고 정상적인 세포 형태가 관찰되었으며, 핵과 세포질 사이의 구별이 명확하였다. 세포학의 유용성을 추가로 확인하기 위하여, OECD TG 439에 근거하여 위양성을 포함한 추가 물질 10 종을 비교시험하였다. 모든 물질(총 16 종)에 대하여, 세포학: 총 면적이 가장 높은 정확도(87.5%)로 피부 자극성을 예측하였으며, 세포학: 세포 수(81.3%), 조직학(75%), 생존율(68.8%) 순으로 자극성이 예측되었다. 이는 세포학이 RhE를 사용한 피부자극시험에서 생존율에 대한 좋은 대안 지표가 될 수 있음을 시사한다.