Discovery of potential compounds targeting DNA damage response for use in cancer

Abstract

PART I. A novel PARP inhibitor, HT-I-138, as a potent therapeutic agent for BRCA1 deficient triple negative breast cancer Breast cancer-susceptibility protein 1 (BRCA1) has an essential role in HR repairing DSBs, and deficiency in BRCA1 renders cells to breast and ovarian cancers. Most of BRCA1 carriers tend to develop triple negative breast cancer (TNBC) that has fewer number of available treatment options. Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) is involved in promoting repair processes of damaged DNA, especially SSBs. PARP inhibition has been suggested as a novel targeted therapy strategy in cancer cells with BRCA1 variants and mutation. In the previous study, a series of 8 compounds synthesized as PARP1 inhibitors was estimated for their PARP1 inhibitory activity in in vitro system. Among these compounds, HT-I-138 showed potent catalytic inhibition activity against PARP1. On the basic of the previous results, I decided to further study that the efficacy of HT-I-138 for the treatment of TNBC regarding the role of BRCA1 status. Further study revealed that HT-I-138 inhibits catalytic activity of PARP1, and traps PARP1 on damaged DNA in HR deficient TNBC cells, BRCA1-mutant or si-BRCA1-transfected cells. As expected, the HT-I-138 showed selectively induce apoptosis in HR deficient TNBC cells compared with BRCA1 wild type TNBC cells. In conclusion, my observations demonstrated that HT-I-138 could become a novel PARP inhibitor that inhibit catalytic activity of PARP1 and trap the PARP1-DNA complexes on DNA lesion in HR deficient TNBC cells. As a result, HT-I-138 could selectively kill HR deficient TNBC cells. PART II. A novel DNA intercalative catalytic topoisomerase I and IIα dual inhibitor DNA topoisomerases have been considered important targets for various type of cancer. While most of marketed drugs belong to topoisomerase poison inhibitor, some potential catalytic inhibitors have been revealed currently as novel agents for cancer treatment with low toxicity profiles. A series of synthesized compounds were evaluated for their topoisomerase I and IIα inhibitory activity and anti-proliferative activity against three human cancer cell lines (DU145, HCT-15 and T-47D). Most compounds exhibited suppressed topoisomerase I and IIα activity and significant anti-proliferative activity as much as positive controls against human cancer cell lines. Among these compounds, ChroNa-7 significantly inhibited topoisomerase I and IIα activity and showed excellent anti-proliferative activity against DU145 (IC50 = 0.13 μM). To confirm the mode of action of ChroNa-7 as a topoisomerase inhibitor, diverse assays including DNA cleavage assay, Alkaline comet assay and Ethidium bromide (EB) displacement assay were performed. ChroNa-7 functioned as intercalative catalytic topoisomerase I and IIα dual inhibitor. Also, ChroNa-7 induced G2/M arrest and apoptosis in DU145 cells that were confirmed by flow cytometry anlaysis and western blotting. Taken together, this study identified ChroNa-7 as a novel topoisomerase I and IIα catalytic inhibiter with low genetic toxicity.;인간의 DNA는 외인적, 내인적 요인에 의해 끊임없이 손상을 받는다. 이러한 DNA 손상은 유전체를 불안정하게 할 수 있고, 세포의 항상성을 유지하기 위해 정확히 복구되어야 한다. 특히, 손상된 DNA의 복구에 관여하는 유전자의 돌연변이는 유전 장애 및 암을 유발할 수 있다. 세포에는 DNA 손상 요인에 따른 다양한 DNA 복구 기작이 존재한다. 암의 가장 일반적인 특징은 유전체의 불안정성이다. 불완전한 DNA 복구 기작은 암 유발에 관여할 뿐만 아니라, 암의 치명적인 약점이 될 수 있다. 현재까지, 유전체의 안정성 또는 DNA 복구 기작에 관여하는 항암제들이 개발되어 임상시험이 진행 중이다. 토포아이소머레이즈를 표적하는 Camptothecin과 Etoposide와 같은 약물을 시작으로, 최근에는 팔프를 표적하는 억제제가 지속적으로 개발 중이며 미국 식품의약국에 승인되기도 했다. 브라카1 단백질은 손상된 DNA 이중 가닥 복구에 중요한 역할을 한다. 특히, 브라카1의 유전자 변이를 가진 사람의 경우 삼중 음성 유방암의 발병 위험률은 높다. 삼중 음성 유방암은 호르몬 수용체의 결핍으로 인해 표적 치료에 한계가 있으며, 예후가 좋지 않은 것으로 알려져 있다. 팔프는 주로 손상된 DNA 단일 가닥의 복구에 관여한다. 팔프 억제제는 브라카1에 변이가 있는 암을 표적으로 하는 새로운 치료 전략으로 제시되고 있다. 이전 연구에서, 팔프 억제제로 합성되어진 8 개의 화합물에 대한 억제 활성도 검사를 in vitro 상에서 진행하였다. 이들 화합물 중에서 HT-I-138의 팔프 억제능이 가장 뛰어남을 확인하였다. 본 연구에서는 브라카1의 결핍 여부에 따른 삼중 음성 유방암에서의 HT-I-138 효능을 확인하기로 하였다. 세포 수준에서의 HT-I-138 효능을 확인한 결과, HT-I-138이 브라카1이 저해되거나 돌연변이된 삼중 음성 유방암 세포에서 선택적으로 팔프의 촉매 활성을 저해하고 세포사멸사를 유도한다는 것을 확인하였다. 또한, 손상된 DNA에 결합된 팔프를 포획함으로써 DNA 손상을 유발하는 것을 확인하였다. 이러한 사실들을 바탕으로, HT-I-138이 브라카1이 결핍된 삼중 음성 유방암 세포에서 선택적으로 세포사멸을 유도할 수 있는 팔프 저해제가 될 수 있음을 확인하였다. 토포아이소머레이즈는 DNA의 이중 가닥 또는 단일 가닥의 절단을 통해 DNA 복제 과정에서 발생하는 DNA의 위상학적 문제를 해결하는 효소이다. 본 연구에서는, 토포아이소머레이즈 억제제로 개발된 24개의 화합물에 대한 활성 억제능 평가와 3 가지 암세포주에 대한 세포 독성 평가를 진행하였다. 이를 바탕으로, 저농도에서 토포아이소머레이즈 I과 IIα를 효과적으로 억제하고 전립선암에서 뛰어난 항 증식 활성을 보인 ChroNa-7에 대하여 추가적으로 억제 기작을 알아보기 위한 실험들을 진행하였다. 이를 통해, ChroNa-7이 DNA의 손상을 적게 유도하고 DNA에 삽입되면서 작용하는 토포아이소머레이즈 촉매 억제제임을 확인하였다. 또한, 유세포분석과 웨스턴 블랏팅을 통하여 ChroNa-7이 G2/M기의 정지를 일으켜 세포 사멸사를 유도한다는 것을 확인하였다. 이를 종합하여, ChroNa-7이 적은 DNA독성을 유발하면서 효과적으로 작용할 수 있는 토포아이소머레이즈를 표적하는 촉매 억제제가 될 수 있음을 확인하였다.