The effect of hyperlipidemia on the interaction of lymphatic endothelial cells with leukocytes

Abstract

서구화된 식단으로 인한 고지혈증의 증가는 전세계적으로 문제가 되고 있으며, 이로 인해 심혈관계 질환을 유발할 수 있다는 사실이 잘 알려져 있다. 고지혈증이나 동맥경화 등을 모델로 한 동물 실험과 임상 실험들은 대부분 혈관이나 혈관내피세포를 표적으로 널리 연구되고 있지만, 혈관과 비슷하게 림프구 운송에 관여하는 것으로 알려진 림프관의 기능에 대한 연구는 아직 충분히 이루어지지 않았다. 따라서 식이를 통한 고지혈증 마우스 모델을 수립하고, 면역 세포 이동에 관여할 수 있는 림프관내피세포의 표지자를 찾고자 하였다. 본 연구에서는 고지혈증이 림프관내피세포에 미치는 영향을 확인하기 위해, 포화지방산의 일종인 팔미르산을 처리했을 때 나타나는 림프관내피세포의 특성을 조사하였다. 세포 독성이 나타나지 않는 100 μM의 팔미르산을 24시간 동안 림프관내피세포주인 SVEC4-10 세포에 처리하고, 대조군과 비교하면 팔미르산을 처리한 군의 세포 증식과 관 형성이 증가하며, 여기에 관여하는 것으로 알려진 혈관 성장인자들(Vegfc, Vegfd, Vegfr3, Nrp2)의 발현이 증가하였다. 팔미르산 처리 후 시간에 따라 림프관내피세포 특이적인 표지자인 Lyve-1과 Pdpn의 발현이 다르게 나타나며, 내피세포가 활성화 되었음을 알려주는 유착분자인 VCAM-1의 발현 또한 증가하였다. 다음으로 팔미르산에 의해 활성화 된 림프관내피세포주의 다양한 유전자 변화를 알아보기 위해 마이크로어레이를 시행하였다. 그 결과, 염증 환경에서 나타나는 사이토카인과 케모카인의 발현이 특이적으로 증가한 것을 확인하고, 톨유사수용체 4를 발현하는 SVEC4-10 세포주에서 팔미르산에 의한 염증성 사이토카인과 케모카인의 유전자 발현이 증가한다는 것을 보았다. 그외에도 팔미르산 자극은 SVEC4-10의 다양한 GTPase와 GTP-binding protein의 발현을 증가시키며, small GTPase 중 Rhoa 저해제인 rhosin hydrochloride를 처리했을 때, SVEC4-10 세포주의 관 형성과 케모카인 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 이러한 세포 실험 결과가 고지혈증 동물 모델과 일치하는지 알아보기 위해, 고콜레스테롤과 고지방식이를 17주간 실시한 고지혈증 마우스의 혈액에서 총콜레스테롤과 총중성지방, 지질단백질의 농도를 측정했을 때, 대조군에 비해 총콜레스테롤과 지질단백질의 농도가 유의하게 증가한 고지혈증이 유발된 사실을 확인하였다. 또한 식이에 따라 총중성지방이 달라지는 것을 보았지만, 마우스의 피부와 림프절에서 공통적으로 LYVE-1 양성 림프관내피세포의 확장을 관찰하였기 때문에, 우리는 이러한 림프관의 변화는 혈액 내 고콜레스테롤에 인한 작용이라 추측하였다. 마우스 림프절 내의 면역세포 분포에서도 대조군과 고지혈증 유발 마우스 간의 차이가 있었고, 이것을 확인하기 위한 실험으로 세포주를 이용한 transwell 이동성 실험을 고안하였다. 그 결과, T 림프구 세포주인 EL4 세포가 팔미르산을 처리한 SVEC4-10 세포주 쪽으로 이동이 증가하는 것을 확인하였다. A20과 RAW264.7 세포주는 오히려 팔미르산을 처리하지 않은 SVEC4-10 세포주 쪽으로의 이동이 가장 많았으며, 이러한 이동성에 대한 기전을 알아보기 위해 림프구 세포주들에게 팔미르산을 처리하고 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 세포주들의 케모카인 수용체 발현을 확인한 결과, EL4 세포주에서만 팔미르산에 의해 특이적으로 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 요약하자면, 본 논문에서는 고지혈증이 림프관의 활성화를 유도하고, 활성화된 림프관이 발현하는 케모카인이 T 림프구의 림프절 유입에 관여할 수 있다는 것을 입증하였다. ;Hyperlipidemia from a Westernized diet is already a global problem, and it is well known to lead to cardiovascular diseases. Several animal and clinical trials based on hyperlipidemia or arteriosclerosis have been studied for the functions of blood vessels (BVs), but researches regarding the function of lymphatic vessels (LVs) that are similar to blood vessels, which are known to be involved in leukocyte transport, are few. Therefore, activation of lymphatic endothelial cells (LECs) by palmitic acid (PA) treatment was confirmed, and a diet-induced hyperlipidemia mouse model was established. After 24 h of PA treatment of SVEC4-10 cells, the PA-treated group increased cell proliferation, tube formation, and vascular growth factor expression (Vegfc, Vegfd, Vegfr3, and Nrp2), compared with the control group. The expression of LEC markers, such as lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE-1) and podoplanin, was time-dependently different, and vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1), an indicator of the activation of endothelial cells expressed on the cell surface, also increased. A microarray was used to investigate more genetic changes in PA-activated SVEC4-10 cells. As a result, the expression of cytokines and chemokines in the inflammatory environment was observed to be specifically increased, and the Toll-like receptor 4-expressing SVEC4-10 cells promoted the expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines induced by the PA treatment. Also, PA treatment enhanced the expression of various members of the GTPase family and GTP-binding proteins of SVEC4-10 cells, and treatment with rhosin hydrochloride, a RhoA inhibitor among small GTPases, proved that tube formation and chemokine expression were inhibited in PA-treated SVEC4-10 cells. Total cholesterol, total triglyceride, and lipoprotein levels in the blood of hyperlipidemic mice subjected to a high-cholesterol and high-fat diet for 17 weeks were measured and compared with the control group to determine whether the results of these cell experiments are consistent with the hyperlipidemic animal model. The increase in body weight and total triglycerides was found only in the high-fat diet (HFD) group, whereas total cholesterol level increase was observed in both the HFD and the high-cholesterol diet (HCD) groups. The lymph nodes (LNs) of HFD and HCD mice showed an increased number of LYVE-1 positive cells, and mice skin were observed to have expanded LVs. Regarding the leukocyte population in mouse LNs, there was a difference between the control group and hyperlipidemic mice, and a transwell migration assay using a cell line (EL4, A20 and RAW264.7 cells) was designed as a confirmatory experiment. As a result, it was confirmed that EL4 cells increased toward the PA-treated SVEC4-10 cell culture medium. The A20 and RAW264.7 cell lines were the most likely to migrate toward the SVEC4-10 cell line without PA, and in order to investigate the mechanism behind this migration, leukocyte cell lines were subjected to PA treatment, followed by real-time PCR. Furthermore, chemokine receptor expression was specifically increased by the PA treatment only in the EL4 cell line. In summary, this paper showed that hyperlipidemia induces the activation of LVs, and that chemokines expressed by activated LVs may be involved in LNs entrance of T lymphocytes. In future experiments, it is important to observe the immune response that occurs through antigen inoculation, find specific markers, and predict the immune response that can actually cause cancer, vaccination, and infectious disease in patients accompanied by hyperlipidemia