Isolation of Vibrio parahaemolyticus-infecting bacteriophage VPT02 and its potential as a biocontrol agent

Abstract

Vibrio parahaemolyticus is a food-borne pathogen that frequently causes human illness in every summer. Three bacteriophages, VPT01, VPG01, and VPT02, which are infecting Vibrio parahaemolyticus ATCC 33844, were isolated from oysters farmed in Tong-yeong and Go-heung. Host range of VPT02 was determined using 22 food-borne pathogens. Plaque was formed on a lawn of only 6 strains and other bacterial strains had no infection. As a result of host range analysis, Vibrio parahaemolyticus ATCC 33844 strain formed clear plaque was designated as reference host strain in this study. All three bacteriophages were characterized as Siphoviridae family. Characterization was performed with VPT02 shown the high infectivity in Vibrio parahaemolyticus ATCC 33844. Over 80% of VPT02 adsorbed in 15 minutes of Vibrio parahaemolyticus ATCC 33844. One-step growth curve of VPT02 was performed and revealed eclipse period of 5 minutes, a latent period of 20 minutes, and a burst size of 208 PFU per infected cell. Bacteriophage VPT02 was stable in broad range of pH and temperature, indicating that VPT02 may be used under various conditions in food industry. To prove the ability as a bio-control agent of bacteriophage VPT02, survival test was performed in in vivo nauplii infection model. Furthermore, the synergistic effect on survival was identified in in vivo Artemia franciscana by the treatment of phage VPT02 with QStatin, which is already known as quorum-sensing inhibitor. In addition, to identify if quorum-sensing of bacterial cell-to-cell communication affected susceptibility and resistance of phage infection, quorum-sensing mutants were constructed by PCR-mediated linker-scanning mutagenesis and measured their growth after phage infection. This study suggests a potential of VPT02 as a biocontrol and therapeutic agent in the food industry.;장염비브리오균은 식품 섭취로 매개되는 병원균으로서 매년 여름마다 수시로 인간에게 질병을 유발한다. 이에 본 연구에서는 장염비브리오균을 감염하는 3개의 박테리오파지 VPT01, VPT02, VPTG01를 통영과 고흥에서 재배된 굴로부터 분리하였고, 생물적방제로서의 특성 및 이용 가능성을 평가하였다. 박테리오파지 VPT02의 숙주특이성을 확인하기 위하여 22개의 식품 매개 병원균에 시험하여 숙주범위를 결정하였다. 6개 균주의 lawn에서 플라크가 형성되었고, 다른 세균 균주들은 파지에 감염되지 않았다. 숙주 범위 분석의 결과, 장염비브리오균의 ATCC 33844 균주에서 선명한 플라크를 형성했기 때문에 본 연구의 표준 숙주 균주로 사용되었다. 세 개의 박테리오파지의 형태학적 분석 결과, 모두 Siphoviridae과에 속하는 박테리오파지인 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 장염비브리오균의 ATCC 33844 균주에서 가장 높은 감염성을 보인 VPT02의 특징을 규명하였다. 80% 이상의 VPT02는 장염비브리오균 ATCC 33844 균주에 15분만에 흡착되었다. VPT02의 one-step growth curve를 통하여 5분의 eclipse period, 20분의 잠복기를 밝혀냈고, 감염세포 1개당 208PFU의 burst size를 나타내는 것을 확인하였다. 박테리오파지 VPT02는 광범위한 pH와 온도조건에서 안정적이었으며, 이는 VPT02를 다양한 온도 및 pH 조건의 식품 산업에서 이용할 수 있는 가능성이 있을 보여준다. 박테리오파지 VPT02의 생물적 방제로서의 이용가능성을 입증하기 위하여 브라인쉬림프 감염 모델에서 생체내 실험을 실시하여 생존율을 확인하였다. 또한 선행연구에서 쿼럼센싱 억제제로 밝혀낸 QStatin과 본 연구의 박테리오파지 VPT02의 조합처리로 브라인쉬림프 감염 모델의 생존율 향상에 대한 상승효과가 확인되었다. 추가적으로, 세균 간의 의사소통인 쿼럼센싱이 파지 감염의 민감성과 저항성에 영향을 미치는지 확인하기 위해, PCR을 매개하여 쿼럼센싱 유전자를 삭제한 돌연변이 균주를 제작하였고, 해당 돌연변이 균주에 파지를 감염하여 균의 성장을 측정 및 비교하였다. 결론적으로, 본 연구는 식품 산업에서 VPT02의 생물적 방제 및 치료제로서의 이용가능성을 제시한다.