Expression and purification of alginate lyase from Pseudoalteromonas sp. BSi20429

Abstract

In this study, enzymes were used to degrade the molecule of alginic acid in brown algae. Alginic acid with rich complex polysaccharides has a high nutritional value. However, there are difficulties to use as food additive. Long time is required to dissolve the alginic acid. It has particularly low solubility in the alcohol-containing solvent. Also, viscosity increases in higher concentration of it. So, there have been many studies that lower the molecular weight of alginic acid to overcome these problems. Cloning was performed to obtain an enzyme that degrades alginate. Then, the obtained gene sequence was analyzed by BLAST (NCBI). Based on the previous procedure, characterization of the enzyme was performed. In order to express the protein, the concentration of IPTG and incubation temperature were optimized to convert into a soluble form. Subsequently, the vector was purified using GST-tag. In this study, the enzyme that degrades the alginate was found. It was also found the optimal condition for degrading alginate using this enzyme. This found enzyme can be used to lower cholesterol levels and can also be used as functional food additives for health care or biofuels. Likewise, this will be applied to various fields industrially.;본 연구에서는 효소를 이용하여 갈조류에서 나오는 alginate를 저분화 시키고자 하였다. 본래 alginate는 복합 다당류 형태를 다량 함유하고 있어 매우 영양이 풍부한 식품이다. 하지만 상온에 용해되는 시간이 길고 알코올이 포함된 용매에는 잘 녹지 않으며 농도가 증가함에 따라 점성이 높아지는 한계가 있다. 이러한 단점을 극복하고 식품 고유의 생리적인 기능성을 높이기 위해 저분자화 연구가 이루어지고 있다. 먼저, alginate분해효소인 alginate lyase를 만들기 위해서 유전자효소기능을 가진 Pseudoalteromonas sp. BSi20429로부터 유래된 alg7 유전자를 cloning하였고, 이렇게 얻은 유전자의 sequence는 NCBI의 BLAST를 통해 분석하였다. 그리고 이를 토대로 효소의 characterization을 하였다. 이 과정에서 단백질 활성을 주기 위해 실험과정에서 온도와 IPTG의 농도에 변화를 주어 inclusion body 형태의 단백질을 soluble form의 단백질로 전환시켜주었다. 이어서 단백질의 purification을 하기 위해 vector에 있는 GST-tag을 이용해 정제하였다. 다음으로 효소의 활성을 측정하여 효소가 alginate를 분해하기 위한 알맞은 조건을 찾을 수 있었다. 본 연구에서 합성한 효소를 대량생산하여 산업화할 수 있다면 여러 분야에 유익하게 작용할 수 있을 것이다. 이러한 효소는 저분화된 alginate로써 콜레스테롤 수준을 낮추는데 있어 중요한 천연물로 사용되거나, 향후 biofuel로써 우리 삶에 필요한 대체 자원 및 prebiotics 건강기능 식품 등으로 널리 이용할 수 있을 것으로 사료된다.