Evaluation of the Efficacy of a Novel TCR-Like Antibody Model Targeting OVA 257-264/H-2Kb Complex

Abstract

T Cell Receptor (TCR)-like antibodies, designed to mimic CD8 + T-cell receptors and recognize antigen-specific MHC-peptide complexes, are capable of targeting low-density antigens. As a form of immunotherapy, TCR-like antibodies have been reported to have therapeutic effects on cancer cells or virus-infected cells. To obtain a TCR-like antibody model for a specific MHC-CTL epitope complex, scFv (single-chain antibody Fv domain) that recognizes the H-2Kb bound to OVA 257-264 (SIINFEKL), an immunodominant epitope of ovalbumin (OVAp/H-2Kb), was obtained by screening the bacteriophage library. Then, the human IgG1-OVA monoclonal antibody (KbOv-27 mAb) was prepared by separating VH and VL from this scFv and converting them into human whole IgG form. To evaluate the efficacy of this antibody, the ability of the KbOV-27 mAb to specifically recognize cells with the OVAp/H-2Kb complex was examined. The OVA 257-264 peptide was attached to EL4 cells, a murine lymphoma cell line with H-2Kb expression, and the specific binding of KbOv-27 mAb was tested. The experiment demonstrated that the amount of KbOv-27 mAb binding was proportional to the pMHC complex density. Quantitative determination of the binding affinity of KbOv-27 mAb revealed a KD value of 2.83μM. To test whether naturally processed antigens can be recognized by KbOv-27 mAb, splenocytes obtained from OT-I mice were infected with OVA-expressing recombinant vaccinia virus (VV-OVA) and analyzed by flow cytometry. The results showed that KbOv-27 mAb could bind the OVAp/H2Kb complex presented by the infected macrophages. Finally, to examine whether KbOv-27 mAb can induce the death of OVAp/H2Kb expressing cells in vivo, C57BL/6 mice were injected with either the C57BL/6 mouse splenocytes pulsed with OVA 257-264 peptide (target cells) which were already bound to KbOv-27 mAb or the target cells and the antibody separately in the tail vein. The result showed that KbOv-27 mAb was able to specifically remove the OVA257-264 pulsed target cells in vivo as well. These results demonstrate that KbOv-27 mAb specifically recognizes the OVAp/H-2Kb complex and induces specific elimination of OVAp/H-2Kb-presenting target cells in the body. This study provides a proof of concept of TCR-like antibodies, suggesting that these antibodies could be widely used for diagnosis or anticancer and antiviral therapy.;CD8+T-cell의 수용체를 모방하여 항원에 특이적인 MHC-펩타이드 복합체를 인식할 수 있도록 만들어진 T Cell Receptor (TCR)-like antibody는 밀집도가 낮은 항원을 표적으로 삼을 수 있다. 이는 면역요법 중 하나로서 TCR-like antibody는 암세포 혹은 바이러스 감염 세포에 치료효과를 나타내는 연구가 보고된 바 있다. 이를 토대로 우리는 특정 MHC-CTL 에피토프 복합체에 대한 TCR-like antibody 모델을 얻기 위해 박테리오파지 라이브러리 스크리닝을 통하여 Ovalbumin(OVA)의 면역 우세 항원결정기(epitope)인 OVA 257-264 (SIINFEKL) 펩타이드가 결합한 H-2Kb 복합체(OVAp/H-2Kb)의 scFv (single-chain antibody Fv domain)를 얻었다. 이 scFv에서 분리한 VH, VL을 Human Whole IgG 형태에 전환시켜 Human IgG1-OVA 단클론 항체(KbOv-27 단클론 항체)를 제작하였다. KbOv-27 단클론 항체의 특징을 평가하기 위해, KbOV-27 단클론 항체가 OVAp/H-2Kb 복합체를 갖는 세포를 특이적으로 인식할 수 있는지 알아보았다. 마우스 림프종 세포주인 EL4 세포에 OVA 257-264 펩타이드를 pulsing하여 KbOv-27 단클론 항체의 특이적 결합 유무를 확인하였다. 실험결과는 KbOv-27 단클론 항체가 pMHC 복합체 밀도에 의존적으로 반응하였다. KbOV-27 단클론 항체와 항원간의 dissociation constant가 2.83uM(KD)정도 친화력을 나타내었다. 이 항체가 자연처리항원을 인식할 수 있는지 알아보기 위해, 시험관 내에서 OVA를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 (VV-OVA) 를 OT-I 마우스 비장세포에 감염시킨 후에 대식세포에서 제시되는 OVAp/H-2Kb 복합체에 KbOv27 단클론 항체가 결합하는 것을 유동 세포 분석법으로 확인하였다. 마우스 생체 내에서 KbOv-27 단클론 항체가 살해 활성(Killing Activity)능력이 있는지 확인하기 위해, OVA 257-264 펩타이드를 pulsing한 C57BL/6 마우스 비장세포에 KbOv-27 단클론 항체를 결합시켜 주입하고, 표적세포와 KbOV-27 단클론 항체를 각각 C57BL/6 마우스의 꼬리정맥으로 투여하였다. 그 결과, KbOv-27 단클론 항체가 OVA 257-264를 갖는 표적세포를 특이적으로 제거하는 것을 확인 하였다. 이상의 결과를 통해 KbOv-27 단클론 항체가 OVAp/H-2Kb 복합체만을 특이적으로 인식하고 체내에 있는 표적 세포를 제거할 수 있다는 것이 입증되었다. 그리고 TCR-like antibody의 개념을 검증하여 이러한 항체가 진단 또는 항암 및 항바이러스 치료에 사용될 수 있는 가능성을 제시한다.