Functional characterization of Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1 in differentiation of neuroblastoma cells and neural precursor cells

Abstract

Ubiquitin C-terminal hydrolase L1(UCHL1)은 신경세포와 신경내분비세포에서 특이적으로 많이 발현되며, 신경 분화가 일어나면 그 발현이 증가된다. UCHL1은 퇴행성 신경질환과 신경 발생에 연관이 있으며, 암에서의 역할도 활발히 연구되고 있다. 신경모세포종(Neuroblastoma)은 유아기에 가장 많이 진단되는 종양이다. 신경모세포종의 분화 정도는 환자의 생존율과 깊은 연관이 있는데, 레티노산(Retinoic acid, RA)은 신경모세포종의 분화를 효과적으로 유도하는 물질이다. 그러나 레티노산을 이용한 치료는 신경모세포종 세포주뿐만 아니라 임상에서도 저항성이 나타났기 때문에 신경모세포종 분화의 분자적 기제를 밝혀내는 것은 매우 중요한 일이다. UCHL1은 분화가 잘 된 신경모세포종에서 높은 발현을 띄며, UCHL1의 발현이 높은 신경모세포종 환자군은 그렇지 않은 환자군에 비해 생존율이 좋다. 신경 전구 세포(Neural precursor cells, NPCs)는 신경세포, 별아교세포, 희소돌기신경교로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포로, 첨가되는 인자나 기질에 따라 분화가 다르게 유도되는 성질을 가진다. 선천적으로 UCHL1 결핍이 있는 쥐는 대조군과 신경 전구 세포의 형태가 다르고 이는 결국 신경 발생에 영향을 준다. 이 연구는 선행 연구를 바탕으로 신경 분화에서 UCHL1의 역할이 무엇인지 조금 더 명확하게 규명하기 위해 진행되었다. 우선 UCHL1이 인간 신경모세포종 세포주인 BE2C 세포에서 발현되는 것을 실험적으로 확인하였다. 또한 배아 발생 12.5일 쥐의 뇌와 배아 발생 12.5일 쥐의 대뇌피질에서 얻은 신경 전구 세포에서 UCHL1이 발현되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 분화가 진행됨에 따라 BE2C 세포와 신경 전구 세포에서 모두 UCHL1의 발현이 더 강해지는 것을 확인하였다. 쥐의 뇌에서 얻은 cDNA와 mir30-based shRNA를 이용해 UCHL1 과발현 바이러스와 UCHL1 발현억제 바이러스를 제작하였다. 이들이 효과적으로 UCHL1의 과발현과 발현억제를 일으키는지를 확인한 후 기능 연구를 진행하였다. BE2C 세포의 레티노산에 의해 유도되는 분화에서 UCHL1이 과발현 되었을 때 신경모세포종 분화 표지자들의 발현이 소폭 증가하고, 발현억제 되었을 때는 그 발현이 줄어든다는 것을 확인하였다. 신경 전구 세포의 분화에서는 UCHL1의 발현 정도가 special AT-rich sequence-binding protein 2(SATB2)를 발현하는 세포 수의 변화를 일으킨다는 것을 찾아내었다. 이러한 연구결과는 UCHL1이 뇌에서 전반적으로 많이 발현할 뿐만 아니라, 그 발현 정도가 신경모세포종의 레티노산에 의해 유도되는 분화와 신경 전구 세포의 분화에 관련되어 있음을 시사한다.;Ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (UCHL1) is specifically and highly expressed in neurons and neuroendocrine cells. UCHL1 expression level is increased as the neuronal differentiation proceeds. UCHL1 is known to be related to neurodegenerative disorders and neurogenesis, and the role of UCHL1 in cancer has also been excessively investigated. Neuroblastoma is the most common type of solid tumor in infants. Differentiation of neuroblastoma is related to the survival rate of the patient, and retinoic acid (RA) effectively induces neuroblastoma differentiation. However, resistance to RA treatment was observed not only in neuroblastoma cell lines but also in patients. Therefore discovering the underlying mechanism of neuroblastoma differentiation is an important task. UCHL1 is highly expressed in well-differentiated neuroblastoma. Patients with high UCHL1 expression showed significantly good survival rate compared to the patients with low UCHL1 expression. Neural precursor cells (NPCs) have the ability to differentiate to neuron, astrocyte, and oligodendrocyte. In in vitro culture of NPCs, the existence of soluble factors and substrate molecules plays a critical role in these differentiation decisions. NPCs from UCHL1 deficient mouse has altered morphology compared with controls, which leads to changes during neurogenesis. In this study, UCHL1 expression was confirmed in human neuroblastoma cell line BE2C cell, embryonic day 12.5 mouse brain, and embryonic day 12.5 mouse brain derived NPCs. I verified that the expression of UCHL1 increases as the neuronal differentiation proceeds in BE2C cell and NPCs. UCHL1 overexpression and knockdown vectors were generated respectively using mouse whole brain cDNA and mir30-based shRNA. The overexpression and knockdown viruses were established to be effective and were used for further investigation. I showed that the UCHL1 knockdown decreases various neuroblastoma differentiation markers on differentiated neuroblastoma cells, and overexpression of UCHL1 has the opposite effect. Also, I showed that the UCHL1 expression level regulates the neuronal differentiation of NPCs by the altering the number of cells expressing Special AT-rich sequence-binding protein (SATB2). These findings suggest that UCHL1 is not only abundantly expressed in the brain but also the expression level of UCHL1 is associated with the RA induced differentiation of neuroblastoma cells and neuronal differentiation of NPCs.