Screening of Cathepsin S inhibitors for recovery of BRCA1 protein stability and induction of BRCA1 by Pemetrexed

Abstract

BRCA1 (breast cancer susceptibility gene 1) is a tumor suppressor involved in basic cellular functions necessary for cell proliferation and DNA repairing, but mutations or low expression of the BRCA1 lead to impaired mammary gland differentiation and increase in the risks of breast cancer development. Cathepsin S (CTSS) is a cysteine protease that has been thought to play a role in many physiological and pathological processes including tumor growth, metastasis and immune disorders. Previously, our research team revealed BRCA1 stability is regulated by CTSS and that cleavage of the BRCT domain of BRCA1 by CTSS is important for the ubiquitin-mediated degradation of BRCA1. From the previous study, I assumed CTSS inhibition is a good strategy for functional restoration of BRCA1 in breast cancers with reduced BRCA1 protein stability. Thus, I optimized the more druggable CTSS inhibitor from in vitro data among the 10 FDA-approved drug candidates which were primarily sorted from a large library of FDA-approved drugs using by in silico high-throughput screening. Pemetrexed, a folate antimetabolite chemotherapy agent, was the most found to induce BRCA1 protein among the candidate drugs. In addition, the animal study with Pemetrexed showed the delay of tumor growth in a xenograft mouse model, also showing the inhibition of tumor cell proliferation. However, interestingly, I identified induction of BRCA1 by Pemetrexed was not only related to CTSS inhibition, but other unknown mechanisms primarily which might be associated with homologous recombination (HR) pathway. Although the role of BRCA1 in HR pathway has been demonstrated through various researches, the study of the relationship between BRCA1 and Pemetrexed is largely unknown. Therefore, the results suggest that induction of BRCA1 by Pemetrexed could be related to DNA repair processes such as HR pathway, but further detailed study is needed to reveal this phenomenon. ;BRCA1은 종양 억제 유전자로, 세포 증식 및 손상된 DNA 복구 기전과 같은 기초적인 세포 기능에 필수적이며, 해당 유전자의 돌연변이가 발생하거나 단백질 발현이 저하될 경우 유선 발달 과정에서 장애를 일으켜 유방암의 발생 확률을 높이게 된다. CTSS는 시스테인 단백질 분해효소로서, 종양의 성장과 전이 및 면역 질환 등 다양한 생리적 및 병리적 과정에서 주요한 역할을 한다. 최근 우리 연구팀은 CTSS가 BRCA1의 DNA 복구 기능과 관련이 있는 BRCT 도메인에 결합하며, 해당 도메인을 유비퀴틴을 매개로 분해하는 것을 밝혔다. 이를 바탕으로, 만약 CTSS를 저해한다면 BRCA1의 BRCT 도메인의 분해 또한 저해되어 결론적으로 BRCA1의 기능을 회복할 수 있다는 가설을 설정하였다. 우선, 분자 모델링 시스템을 이용하여 구조적으로 CTSS 저해 가능성이 큰 FDA 기허가 약물 10가지를 선별하였다. 추려낸 10가지 후보 약물을 바탕으로, 시험관 내 실험을 통하여 가장 유력한 CTSS 저해 물질로 Pemetrexed를 최종 선별하였다. Pemetrexed는 엽산 항대사 화학요법제로 인간 TNBC 세포주인 MDA-MB-231 세포주에 처리 시, BRCA1 단백질 발현을 가장 증가시켰으며, 큰 세포 독성은 나타나지 않았다. 또한, 마우스 종양 모델을 이용한 동물 실험 결과, Pemetrexed를 투여한 마우스 군에서 종양 성장이 저해되는 것을 확인할 수 있었으며, 세포 증식 또한 억제된 것을 확인할 수 있었다. 하지만 흥미롭게도 Pemetrexed에 의한 BRCA1의 증가는 오직 CTSS만을 매개하여 유도된 것이 아니며, CTSS와 별개로 밝혀지지 않은 기전을 통하여 발생할 수 있음을 확인하였다. 또한, 이러한 현상은 상동 재조합 DNA 수복 기전과 관련되어 있을 것이라고 예상하였다. 상동 재조합 DNA 수복 기전에서 BRCA1의 역할은 여러 연구를 통하여 잘 알려졌으나, BRCA1과 Pemetrexed 간의 관련성을 연구한 내용은 드물다. 결론적으로, 본 실험의 연구 내용을 바탕으로 Pemetrexed가 CTSS 저해를 통한 BRCA1 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있으나, CTSS 매개 기전과 별개로 BRCA1의 발현을 유도하는 것을 확인하였다. 이러한 현상은 상동 재조합 DNA 수복 기전과 관련성이 있을 것이라고 예상되며, 해당 부분에 대한 상세한 기전 연구가 더욱 필요하다.