Di-2-ethylhexylphthalate promotes thyroid cell proliferation in vitro and in vivo & Radiosensitivity depending on Cathepsin S expression in TNBC

Abstract

Part 1. Abstract Phthalates are being implied to be related to altered thyroid function and cell proliferation, however, circumstantial pathways still stayed unclear. For this reason, we inspected the phenomenon of di-(2ethylhexyl) phthalate (DEHP) on DNA damage and proliferation in thyroid using thyroid carcinoma cell line 8505C. Exposure to DHEP induced thyroid cell proliferation, as revealed by elevated cell toxicity and DNA synthesis. To elucidated whether DHEP effects shown in vitro may arise in vivo, the thyroid tissues from the rats exposed to DHEP for 13-weeks were suggested. Consonant with the previous report, hyperplasia and hypertrophy of thyroid glands were obvious in the rats exposed to DEHP. This could be additionally helped by increased PAX8 and cyclin E expression as determined by immunohistochemistry (IHC), which achieved statistical significance from 3mg/kg DEHP. In conclusion, these results examine that DEHP induces proliferation in thyroid cell and tissue, providing a significant perception into endocrine interrupting actions of phthalates on thyroid. Part 2. Abstract Triple negative is a type of breast cancer that cannot be hormone therapy because it is negative for estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), and the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2). Therefore, the prognosis is not good and there are no therapeutic solutions. Therefore, based on previous research, revealed that cathepsin S (CTSS) is related to radiation resistance, and CTSS-induced radiation degrades of breast cancer susceptibility gene 1 (BRCA1), we thought that increasing the stability of BRCA1 by inhibiting CTSS could be innovative treatment for TNBC. Five TNBC cell lines were selected based on the difference in expression of CTSS and BRCA1. MDA-MB-231, MDA-MB-453, HCC70 cell lines has Wild type (WT) BRCA1 and MDA-MB-436, HCC1937 cell lines has Mutant type (Mu) BRCA1. Radiation resistance was observed in the HCC70 cell line with high CTSS expression after 10Gy radiation. CTSS was induced time-dependently in each TNBC cell lines with WT BRCA1, and at the same time a degradation in BRCA1 was observed. However, BRCA1 degradation was not observed in TNBC cell lines with mu BRCA1. To construct the xenograft mouse model using MDA-MB-231 cell line, Z-FL-COCHO and RO5461111(1 mg / kg), CTSS specific inhibitors were subcutaneously injected. Treatment of CTSS inhibitors decreased tumor size and proliferation potency, while increased expression of BRCA1 was observed. In addition, comparing the expression of BRCA1 and CTSS in TNBC and non-TNBC patient tissues using human tissue arrays yielded the same results. From the data, it was suggested that CTSS induced the radiation resistance by degradation of BRCA1 and the radiation resistance was alleviated when CTSS was inhibited. Therefore, I proposed that CTSS inhibition is a good strategy for functional restoration of BRCA1 in TNBC with reduced BRCA1 protein stability. ;Part 1. 환경 호르몬 Di-2- 에틸 헥실 프탈레이트가 갑상선암의 증식에 미치는 영향 연구 프탈레이트의 한 종류인 디-(2- 에틸 헥실) 프탈레이트 (DEHP)는 플라스틱의 유연성과 안정성을 높이기 위해 주로 사용되며, 공업용 케이블 뿐 만 아니라 화장품, 어린이용 장난감, 헤어스프레이 등에 함유되어 있다고 알려져 있다. DEHP는 주로 입이나 피부, 기도를 통해 흡수되며, 흡수되어진 DEHP는 비만이나 비정상적인 뇌 발달, 생식기능 이상, 종양형성 등을 유발할 수 있다는 다양한 연구결과들이 존재한다. 특히 내분비계와의 관련성이 강조되며, 그 중 갑상선과의 연관성이 많이 언급되며, 프탈레이트가 갑상선 기능의 변화 및 세포 증식과 관련이 있음은 다양한 연구를 통해 증명되어져 있다. 하지만, 그에 대한 메커니즘은 정확하게 밝혀지지 않았다. 이러한 이유로, 갑상선 암 세포주를 이용하여 갑상선에서 DNA 손상 및 증식에 대한 DEHP 영향을 확인하고자 연구하였다. DHEP에 노출되면 갑상선 세포 증식이 유발되는데, 이는 세포 생존력 및 DNA 합성이 증가한 것으로 밝혀졌다. 세포실험에서 나타난 DHEP 효과가 생체 내에서 발생할 수 있는지를 설명하기 위해, 13 주 동안 DHEP에 노출된 랫트로부터 갑상선 조직을 적출했다. 갑상선의 비대는 DEHP에 노출된 랫트의 조직에서 명백히 나타났다. 이는 면역 조직 화학 염색을 통한 PAX8 및 사이클린 E 발현의 증가를 확인함으로써 추가로 증명할 수 있으며, 이는 3mg/kg DEHP로부터 통계적 유의성을 확인했다. 결론적으로, 이러한 결과는 DEHP가 갑상선 세포 및 조직에서 증 식을 유도하며 갑상선에서 프탈레이트의 내분비계를 방해하는 것을 확인할 수 있다. 앞으로 현재 group 2 발암물질로 분류되어진 DEHP의 더 많은 연구가 수행된다면 DEHP의 분류가 다시 고려되어질 필요성을 제시할 수 있을 것이다. Part 2. TNBC에서 카뎁신 S 발현에 따른 방사선 민감도 삼중 음성 유방암은 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR) 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 음성이기 때문에 호르몬 요법이 될 수 없는 유방암의 한 유형이다. 따라서 예후가 좋지 않으며 뚜렷한 치료법이 제시되지 않는다. 따라서, 카뎁신 S (CTSS)가 방사선 저항성과 관련이 있으며 유방암 감수성 유전자 1 (BRCA1)이 방사선으로 인해 유도된 CTSS에 의해 분해되며, CTSS가 방사선 저항성을 유발한다는 이전 연구에 근거하여, CTSS를 억제함으로써 BRCA1의 안정성을 증가시키는 것이 새로운 삼중 음성 유방암의 접근법이 될 것이라고 생각했다. CTSS 및 BRCA1의 발현 차이에 기초하여 5 개의 TNBC 세포주를 선택했다. MDA-MB231, MDA-MB-453, HCC70 세포주는 야생형 (WT) BRCA1을 가지며 MDAMB-436, HCC1937 세포주는 돌연변이 형 (Mu) BRCA1을 갖는다. 10Gy 방사선 조사 후 높은 CTSS 발현을 갖는 HCC70 세포주에서 방사선 내성이 관찰되었다. 10Gy 조사 후, CTSS는 WT BRCA1을 갖는 TNBC 세포주에서 시간 의존적으로 유도되었고, 동시에 BRCA1의 분해가 관찰되었다. 그러나 BRCA1 분해는 Mu BRCA1을 갖는 TNBC 세포주에서 관찰되지 않았다. MDA-MB-231 세포주를 사용하여 이종 이식 마우스 모델을 구축 후, CTSS 특이적 저분자 저해제인 Z-FL-COCHO 및 RO5461111 (1 mg/kg)을 주사하였다. 약물 투여 동안 종양 크기를 측정하였고 암 조직을 적출하여 조직 면역 염색을 수행하였다. 그 결과 CTSS 저해제 투여에 의해 암 조직 성장이 저해되었고 세포증식능 마커인 Ki67 발현도 저해되었다. 또한, CTSS 저해제 투여에 의해 BRCA1 발현의 증가가 확인되었다. 또한, 인간 유방암 환자의 조직 어레이를 사용하여 TNBC 및 비-TNBC 환자 조직에서 BRCA1 및 CTSS의 발현이 반대로 나타나며, TNBC에서 이러한 효과가 더 유의하게 나타났다. 향후 추가 세포실험을 통한 작용기전 연구가 수행되어야 할 것이며 이러한 연구결과는 삼중 음성 유방암에서 CTSS 억제가 BRCA1의 기능을 회복시킬 수 있는 새로운 치료법이 될 수 있는 가능성을 제시할 수 있을 것이다.