DNA damage induces stochastic multi-site phosphorylation of TAp63α concentrated in interdomain regions reminiscent of circadian timer Period phosphorylation

Abstract

Germ cells possess unusually high but transient resistance to DNA double strand breaks (DSBs) during gestational development. Upon completing meiotic recombination, oocytes during meiosis I dictyate arrest undergo a radical switch in DNA DSB sensitivity. Post-natal dictyate-stage oocytes become suddenly intolerant to very low levels of DNA DSBs induced by ionizing radiation (IR) treatment. TAp63α is a key mediator of DNA damage-induced dictyate-stage oocyte death. A surge in TAp63α expression level occurs in dictyate-stage oocytes, which coincides in timing with DNA DSB sensitivity switch of oocytes. TAp63α mediates death and elimination of DNA damaged oocytes by undergoing phosphorylation and transcriptional activation of downstream cell death-inducing genes, which helps preserve germline genome quality. Our studies indicate TAp63α phosphorylation induction itself is regulated by an auto-feedback regulatory loop involving two stages. Primary phosphorylations induce TAp63α tetramerization and transcriptional activation, which leads to subsequent secondary phosphorylations that presumably mediate cell death. In this study, I sought to distinguish primary from secondary auto-feedback phosphorylation sites using TAp63α affinity purification and mass spectrometry analysis of wild-type vs. auto-feedback TAp63α phosphorylation mutants. Our analysis indicates TAp63α phosphorylation involves greater than one hundred sites mostly clustered in inter-domain regions of TAp63α. Furthermore, primary and secondary phosphorylations appear not restricted to any specific site but appear rather stochastically induced within multi-site phosphorylation domains. The sheer number of phosphorylation sites involved suggests highly dynamic TAp63α regulation. Interestingly, TAp63α multi-site phosphorylations are strongly reminiscent of those of circadian protein, Period, suggesting TAp63α autofeedback phosphorylation functions as a phospho-timer of DNA DSB-induced oocyte death important for meiotic recombination.;이전 연구에 따르면, 발생 초기 단계의 난 모세포(oocyte)는 감수분열 재조합을 수행하기 위하여 스스로 수 백 개의 DNA 이중 가닥 절단 (DNA DSB)을 생성하지만, 이와 같은 극심한 DNA 손상에 저항성을 보인다. 반면, 재조합을 완료한 난 모세포는 곧 바로 DNA 손상에 대한 감수성이 생긴다. 따라서, dictyate 시기의 난 모세포는 전리 방사선(ionizing radiation) 치료에 의한 낮은 수준의 DNA 손상도 견디지 못하고 세포 사멸에 이른다. TAp63α는 dicytate 시기에 발현이 급증하며, 난 모세포의 DNA 손상에 의한 세포사멸 기전의 주요 중재자로 알려져 있다. 즉, DNA가 손상되면 전사인자인 TAp63α가 인산화가 되고 결론적으로 세포사멸 유전자의 전사활성화를 유도하여 손상된 난 모세포를 제거시킨다. 반면, 아직까지 인산화에 의한 TAp63α의 메커니즘(들)은 불분명하다. 특히, 전사 활성화를 매개하는 인산화 잔기는 알려지지 않은 상태이다. 우리의 초기 연구는 TAp63α 인산화가 auto-feedback regulatory loop에 의해 자가 조절된다는 가설을 제시한다. 또한, 인산화는 두 단계로 이루어지며, 전사활성에 필요한 tetramerization의 위한 1차 인산화 그리고 전사활성 이후에는 TAp63α의 분해 및 세포사멸과 관련된 2차 인산화로 구성된다고 주장한다. 이 연구에서는 TAp63α의 auto-feedback regulatory loop 가설을 증명하고자 TAp63α의 정제 및 질량분석기법 (LC-MS/MS)을 통해 1차 및 2차 인산화 잔기를 규명하고자 했다. 결과적으로 TAp63α 인산화는 주로 도메인 사이 지역에 집중되며 1차 및 2차 인산화는 특정 잔기에 국한되어 있기보다는 인산화 밀집부위 내에서 확률적으로 일어나는 것으로 확인되었다. TAp63α 활성화에 관여하는 인산화 잔기의 수 및 조합을 감안할 때, 인산화 조절이 매우 역동적으로 일어난다는 것으로 판단된다. 흥미롭게도 TAp63α의 다중 인산화 (muti-site phosphorylation) 패턴은 circadian rhythm과 관련 전사 단백질, Period에도 보존이 된다는 점을 발견할 수 있었으며, 이는 TAp63α의 인산화도 타이밍 메커니즘을 지닐 가능성을 시사한다.