Part 1. Design and Synthesis of Peptidomimetic Inhibitors Targeting Histamine-Releasing Factor Part 2. Design and Synthetic Studies on Tubulysin Analogs

Abstract

In the first part, design and synthesis of peptidomimetic inhibitors targeting Histamine-Releasing Factor (HRF) were described. Dimerized TCTP-binding peptide 2 (dTBP2) obtained from phage-displayed peptide library binds to dimerized Translationally Controlled Tumor Protein (dTCTP), inhibits IL-8 release induced by dTCTP, and ultimately reduces several allergic symptoms in the animal model of rhinitis. Thus, we have designed and synthesized peptidomimetic libraries (I–V) targeting hot-spots of dTCTP-dTBP2 interaction. The compounds were evaluated by inhibition assay of IL-8 release. Library synthesis and their biological evaluations proceeded alternately. Design and synthesis of the next library were based on biological results of the prior library. We generated total 229 compounds including 88 NHCH2CH2SH-tethered peptides of peptidomimetic library I on HOOC-TentaGel resin, and 4 compounds of peptidomimetic library I hits without NHCH2CH2SH tether and 137 compounds of peptidomimetic libraries II–V via Fmoc-based SPPS using Wang resin. IL-8 release inhibition assay and competition assay were performed at 10 μM concentration for the 141 compounds. Additionally, IC50 values were determined for highly active 66 compounds to identify active compounds unambiguously. 26 compounds showed lower IC50 values than dTBP2 (IC50 = 960 nM) and the most potent compound 110 exhibited an IC50 value of 4.36 nM. Based on these results, 3 compounds (122, 123, and 129) were selected and tested for an allergic rhinitis animal model. Among them, 122 effectively inhibited IL-5 release in bronchoalveolar lavage fluid and decreased the thickness of mucosa in the lung tissue sensitized by OVA. Additionally, we chose 97 and 121, and conducted another animal test for an allergic rhinitis mouse model. However, they didn’t show the significance and consistency between mice. It might need further study to confirm the anti-allergic effect of 97 and 121. We believe that 122 and other 25 compounds are worthwhile for further development to small molecules, furthermore, that may lead to new treatments of allergic diseases. In the second part, studies of design and synthesis of tubulysin analogs were reported. Tubulysins are the secondary metabolites produced from myxobacteria species, Archangium gephyra and Angiococcus disciformis. Mechanistically, tubulysins are known to bind to tubulins, inhibit the polymerization of microtubules during mitosis, and induce apoptosis. In addition, tubulysins display highly more potent cell growth inhibitory activity than other anti-mitotic agents and the potency exceeds the epothilones, vinblastine, and taxol by a factor of 20-1000 folds. Although they exhibit exceptionally potent cell cytotoxicity, their synthetic studies have not been completed yet. Especially, structure-activity relationship study is still in its infancy because of the structural complexity of tubulysins. We introduced a tetrahydropyran ring in Tuv part, simplified C-terminus and N-terminus, and designed conformationally rigid tubulysin analogs. Both of (R)- and (S)- dihydropyranone were successfully obtained via the enantioselective hetero Diels-Alder reaction using Danishefsky’s diene and aldehyde, and compound 4a and 4b showed high enantiomeric excess values (>95%). Introduction of amine group onto the pyranone intermediates 9a and 9b by reductive amination generated 6 compounds 3a–3f having 4 stereoisomers at the tetrahydropyran ring. Modification of C-terminus of these compounds gave 14 final compounds 1a–1n, which had 4 stereoisomers at the tetrahydropyran ring. Lastly, N-terminal modified final compounds 1o–1t were obtained. As a result, we synthesized 20 tubulysin analogs bearing 4 stereoisomers at the tetrahydropyran ring over 11-12 steps for the longest linear sequence, which will be taken forward to biological evaluation against various cancer cell lines. We believe that our simplified/conformationlly rigid analogs of tubulysin will contribute to both the tubulysin SAR study and the development of new anticancer therapeutics.;Part 1은 알레르기 유발 인자인 HRF/TCTP의 작용을 억제하는 펩티도미메틱 물질의 설계 및 합성에 관한 것이다. Heptamer 펩타이드인 dTCTP-binding peptide 2 (dTBP2)는 활성형 TCTP로 예측되는 dTCTP (dimerized Translationally Controlled Tumor Protein)와 결합하여, dTCTP 가 그의 수용체와 결합하는 것을 억제함으로써 항 알레르기 효과를 나타내는 것으로 보이며, 이에 근거하여 본 연구에서는 펩티도미메틱 라이브러리 (I-V)를 설계하고 합성하여 생물학적 유효성을 확인하였다. 라이브러리의 합성에는 Fmoc-based SPPS를 이용하였으며, HOOC-TentaGel resin을 이용하여 88개의 NHCH2CH2SH tether를 붙인 펩타이드 (펩티도미메틱 라이브러리 I) 를 만들었고, 이들 중 4개의 hit 화합물들에 대해서는 Wang resin을 이용하여 NHCH2CH2SH tether가 붙지 않은 화합물로 만들었고 또한 137 개의 펩타이드 (펩티도미메틱 라이브러리 II‒V) 를 Wang resin을 이용하여 만들어서 총 229 개의 펩타이드를 만들었다. 각각의 라이브러리에 대한 IL-8 release inhibition assay를 실시하여 그 결과를 바탕으로 다음 단계의 라이브러리를 설계한 후 합성하였다. 라이브러리 설계의 방향은 heptamer 펩타이드인 dTBP2를 점차적으로 분자량이 작은 화합물로 바꾸어 가는 것이었다. 합성한 모든 화합물들에 대해 10 μM 단일 농도에서 IL-8 release inhibition assay와 competition assay를 실시하여 생물학적 활성을 확인하였고, IL-8 release inhibitory activity를 보다 확실하게 비교하기 위해 상위 66개의 화합물을 선정하여 IC50 value를 측정하였다. 실험 결과, 66개의 화합물들 중 26개의 화합물이 dTBP2 (IC50 = 960 nM) 보다 낮은 IC50 value를 갖는 것으로 나타났고, 이 중 가장 효과적인 화합물인 110의 IC50 value는 4.36 nM로 밝혀졌다. 이 모든 결과를 토대로 3개의 화합물 (122, 123, 그리고 129)을 선정하여 알레르기성 비염 동물 모델을 대상으로 실험한 결과, 122는 bronchoalveolar lavage fluid에서의 IL-5 level을 현저하게 감소시켰고, 또한 폐 조직에 대한 PAS (Periodic Acid-Schiff) 염색 결과 점막의 비후 현상이 현저하게 감소된 것으로 나타났다. 이에 더해서 2개의 화합물 (97 과 121)을 선정하여 알레르기성 비염 동물 모델을 대상으로 추가 실험을 실시하였으나, 이 두가지 화합물의 경우에는 개체간의 유의성이 적게 나왔다. 하지만, 122 를 포함한 26개의 화합물들은 이후 분자량이 작은 화합물로 개발될 가치가 있으며, 또한 알레르기 질환 치료제 개발의 밑거름이 될 것으로 믿는다. Part 2는 강력한 항암 효과를 갖는 것으로 알려진 tubulysin analogs의 설계 및 합성에 관한 연구이다. Myxobacteria인 Archangium gephyra와 Angiococcus disciformis의 이차 대사 산물인 Tubulysins는 튜불린과 결합하여 마이크로튜불의 polymerization을 억제하여 궁극적으로는 세포사멸을 유발하여 항암효과를 갖는 것으로 밝혀졌으며, 그 중 가장 강력한 대사 산물인 tubulysin D의 세포성장억제효과는 유사 기전의 물질들인 epothilones, vinblastine, taxol의 20–1000배인 것으로 알려져 있다. 강력한 효과를 가지고 있음에도 불구하고 구조가 매우 복잡하고 합성이 어렵다는 이유로 구조-활성 관계 연구 (structure-activity relationship study) 는 그다지 활발하게 진행되지 않고 있는 실정이다. 이에 본 연구에서는 simplified/conformationally rigid analogs를 설계하였으며, 모두 4개의 stereoisomers를 갖는 20개의 화합물들을, 가장 긴 linear sequence 를 기준으로 11–12 step에 걸쳐 합성하였다. Dihydropyranone (4a 와 4b) 의 2번 위치의 stereochemistry는 enantioselective hetero Diels-Alder (HAD) reaction을 이용하여 결정하였고, 4번 위치의 stereochemistry는 reductive amination을 이용하여 변화를 주었다 (3a–3f). 특히 (R)- 또는 (S)-BINOL과 Danishefsky’s diene을 사용한 enantioselective hetero Diels-Alder (HAD) reaction을 통해 높은 enantiomeric excess value (> 95%)를 갖는 화합물 4a 와 4b를 합성할 수 있었다. 화합물의 absolute configuration은 9a의 crystal structure로 확인하였다. 이렇게 합성된 20개의 simplified/conformationally rigid analogs가 앞으로 tubulysin의 구조-활성 관계 연구와 새로운 항암제 개발에 기여할 것으로 믿는다.