Ultrasound Neuromodulation of Primary Hippocampal Neurons Cultured on Micro Electrode Arrays

Abstract

Ultrasound is becoming a favorable neuromodulation method due to its noninvasiveness, high spatial selectivity and high penetrating power. As a noninvasive approach, the ultrasound neuromodulation has gained increasing attention for a promising treatment of neurologic diseases. In the past few years, several studies on the ultrasonic neuromodulation have been performed indicating the effectiveness of neuromodulation in the various animal model. Nevertheless, even though it was already known that ultrasonic application affects action potentials in neurons, the underlying principles have not been clearly elucidated yet. In this study, a new experimental setup has been developed to precisely apply the ultrasonic neuromodulation to the neuronal cells cultured on micro electrode arrays (MEAs) and examine the effects of various ultrasound parameters to evoke the neural activity. MEA platform was used as a standard tool to measure electrical signals from cultured neurons via multiple channels over a long period. Primary hippocampal cells were obtained from embryonic 17-18 day Sprague Dawley rats. The hippocampi were dissociated into individual neuronal cells and seeded on to the MEA at the density of 1800 cells/mm2. After the cultured cells were matured approximately at the day in vitro 14 (DIV 14), ultrasonic neuromodulation experiments were performed. In the first preliminary experiment, spike mode ultrasound was applied to the hippocampal neuron networks and the action potentials (APs) was recorded before, during and after ultrasonic stimulation. Moreover, the sonication was repeated for 4 times at the intervals of 20 minute to observed long-term potentiation (LTP). From most of electrodes, the number of APs were increased during ultrasound application. Interestingly, the repeated sonication led to the increase of the frequency of APs. The increased activity maintained even during 20 min after the sonication. Additionally, in order to investigate if the synaptic change is induced by ultrasound exposure, immunocytochemistry was performed staining presynaptic protein. However, no visually noticeable synaptic change was observed. In the second ultrasound neuromodulation setup, the pulse generator was employed to precisely control the sonication parameters. With pulsed ultrasound, 375.4 and 288.6 mW/cm2 acoustic intensity was applied to the neural networks. The number of APs increased after ultrasound stimulation and the increased activity maintained as the irradiation was repeated. Moreover, we confirmed the number of synapse increased finely compared to control through the immunocytochemistry. In order to systematically investigate the effect of various ultrasound parameters, we established in vitro ultrasound neuromodulation setup for parameter study. We defined various variables such as acoustic intensity, duty cycle, sonication duration, and pulse repetition frequency (PRF) applied to neural network. It was found that the acoustic intensity of 7.6 W/cm2 in spatial-peak pulse-average intensity (Isppa) and 3.8 W/cm2 in spatial-peak temporal-average intensity (Ispta), 50 % duty cycle and 1 kHz pulse repetition frequency (PRF) was the most effective to evoke the neuronal activity with 0.5 MHz ultrasound. In addition, we observed the tendency of increasing APs when the tone durst duration is shorter and the acoustic intensity is higher. The ultrasound parameter study was also performed in the presence of bicuculline, an antagonist of GABAA receptors, in order to assess the ultrasound effect solely on the excitatory neurons. Even though no remarkable change was found in terms of ultrasound-evoked APs, the clear suppression of neural activity was observed at the specific conditions. In my knowledge, this study is the first systematic study to assess various ultrasound parameters on cultured neuronal cells. The established system is expected to be a useful tool to investigate the electrophysiological mechanism of ultrasonic neuromodulation. ;뉴로모듈레이션이란 신경시스템의 일부를 전기적 방식이나 화학적 방식으로 활성화시키거나 억제시키는 기술을 말한다. 신경세포는 전기화학적인 신호를 통해 정보를 전달하기 때문에 이러한 기술이 가능하다. 가장 일반적인 방법에는 전기자극 방식이 있다. 그러나 전기자극법은 삽입 수술이 반드시 동반된다는 단점을 안고 있다. 이러한 한계점을 극복하고자 개발 된 것이 비침습적인 방식의 뉴로모듈레이션 기법이다. 대표적으로는 경두개자기자극과 경두개직류자극방식이 있다. 이 두 기술은 비침습적이기는 하나 공간 해상도가 낮아 원하는 부위만을 조율하는 것이 어렵다는 단점이 있다. 이러한 모든 단점을 극복하고자 새롭게 대두 되고 있는 기술이 초음파를 이용한 신경조율법이다. 초음파를 이용한 신경 조율 연구는 1929년, Harvey 가 처음 신경과 근육섬유다발을 자극해 활성도를 변화를 관찰함으로써 시작되었다. 그후로 60년동안 계속적으로 다양한 동물 모델과 초음파 파라 미터로 신경 조율을 관찰하기 위한 실험이 진행되어왔다. 대표적 연구로는 Tyler 그룹이 저주파 저강도 초음파가 신경 네트워크 활성화를 유도하는 것을 마우스 뇌 절편 의 다양한 이온 채널을 시각화 함으로써 관찰하였고, 같은 그룹에서 마취된 쥐 대뇌 에 직접 초음파를 가해 신경조직을 자극하는 실험을 하였다. 또한, Yoo 그룹에서는 체외 상태에서 쥐 대뇌에 다양한 파라미터의 초음파로 자극함으로써 최적의 효율을 갖는 초음파 강도를 쥐의 꼬리움직임을 통해 관찰하였다. 그럼에도 불구하고, 효과적인 초음파 신경 조율을 위한 파라 미터는 아직 명확한 것이 없으며 그 기전 또한 불분명하다. 최근에는, 초음파가 양방향성으로 신경 조율이 가능하다는 잠재력까지 가지고 있어 치료용으로써의 초음파에 대한 기대가 크다. 따라서, 본 연구에서는 평판형 미세 전극 어레이를 이용하여 배양된 해마 세포의 전기적 신호를 체외에서 관찰함으로써 초음파에 의한 영향을 알아보는 실험을 진행하였다. 특정 파라미터에서의 효과와 기전 연구에 대한 초기 실험이 될 수 있는 실험도 함께 진행하였다. 해마 세포는 1800 cells/mm2 의 밀도로 미세 전극 어레이에 배양되며, 14일 이후 실험에 사용되었다. 초기 실험에서는, 초음파 자극 전, 자극 중 그리고 자극 후 1 분을 비교 분석함으로써 초음파에 의해서 활성도가 증가 되는 것을 확인 하였다. 이러한 전기적 활성도 변화는 칼슘 인디케이터를 통해 시각적으로도 동시에 관찰하였다. 더불어 기전 연구의 한 단계로써, 이러한 초음파 조사를 20분 간격으로 반복 조사하였을 때의 활성도 변화를 관찰하였다. 초음파 조사가 반복 될 수록 반응도의 정도가 증가하였으며, 그 증가는 시간이 지난 후에 지속되려는 경향을 보였다. 두번째 실험에서는, 초음파의 세기와 파라 미터 변경을 용이하게 하기 위해서 함수 발생기를 변경하여 장기 강화 효과를 재현하는 실험을 진행하였다. 앞 선 결과와 같이 조사가 반복 될수록 반응도가 증가 하였으며 증가된 상태는 초음파 자극 후에도 계속적으로 유지되었다. 또한 현상에 대한 원인 규명을 위해 시냅스 영역을 면역 화학 기법을 이용하여 염색한 후 차이를 비교하였다. 이러한 실험결과를 토대로, 최적의 초음파 파라미터를 알아보기 위해 셋업을 재정비하여 최종 실험을 진행하였다. 동일한 조건의 반복 실험을 통해 통계적으로 활성화 정도를 분석하기 위해 3D 몰드를 제작하였으며, 초음파 강도, 듀티 사이클, 조사 시간 그리고 펄스 반복 주기의 파라미터를 조합하여 이에 따른 세포의 반응 차이를 대조군과 비교하였다. 또한, 초음파의 양방향성 신경 조율에 대한 기전 연구를 시도하기 위해, 약물 실험을 통해 억제성세포의 활성을 차단함으로써 흥분성세포만의 반응을 확인하였다. 중심 주파수가 0.5 MHz 의 초음파의 경우, 공간-피크 펄스-평균 강도가 7.66 W/cm2, 공간-피크 시간-평균 강도가 3.83 W/cm2, 듀티 사이클 50 %, 그리고 펄스 반복 주기가 1 kHz 일 때 가장 효과적인 활성 반응을 보였다. 더불어, 초음파 펄스 간격이 짧아질수록, 초음파 강도가 증가할수록 활성화 정도가 증가하는 경향성을 확인하였다. 약물 처리를 통한 실험에서는 명확한 반응을 확인 할 수는 없었지만, 억제성뉴런을 차단했음에도 불구하고 활성도가 감소하는 특정 파라미터가 있음을 관찰하였다. 이러한 생체 외 배양된 신경세포에서의 다양한 초음파 파라미터 실험을 설계한 연구는 아직 알려지 바가 없다. 따라서, 다음과 같이 확립된 시스템은 초음파 자극의 전기생리학적 기전 연구를 위한 유용한 셋업으로 이용 될 수 있을 것으로 기대된다.