A role of AlkB homolog 5 (ALKBH5), a RNA demethylase, in Early Adipogenesis

Abstract

Adipocyte composes adipose tissue that regulates not only energy storage but also regulates blood sugar and inflammatory responses through hormone secretion. Excessive accumulation of adipocytes is highly correlated with chronic diseases such as obesity and diabetes, and the incidence of various metabolic diseases may increase if adipogenesis is not tightly controlled. Although the cell differentiation is known to be regulated by epigenetic mechanism, the link of epigenetic mechanism to adipogenesis is not fully understood. Recently, RNA methylation has been discovered to contribute to RNA metabolism, including RNA splicing, nuclear transport, and stability. It is involved in cell differentiation such as spermatogenesis. However, it is not unclear whether and how RNA modification might play a role in adipogenesis. In this study, we investigated the effect of a RNA demethylase, Alkylation repair homologs 5 (ALKBH5), on early adipogenesis. Genome wide expression data were analyzed by differential expression genes (DEGs) and Gene ontology (GO) term in order to investigate the involvement of epigenetic factors in the early stage of adipogenesis. Expression of RNA modifiers was dominantly changed when epigenetic factors modifying nucleic acids were screened. Among them, ALKBH5 was selected for further investigation. As a result, suppression of Alkbh5 gene expression promoted initiation of adipogenesis, showing increased expression of Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARɤ) and accumulation of triglyceride. In particular, RNA sequencing was performed to examine target genes regulated by ALKBH5. Expression of the CCAAT/enhancer binding proteins β (Cebpβ) gene, known as an early adipogenesis marker, was the most downregulated gene, which was confirmed by quantitative RT-PCR. Secondary analysis of expression of white adipose tissue (WAT) and brown adipose tissue (BAT) revealed that the expression of Cebpβ gene was significantly lower in WAT compared to BAT. Next, the amount of N6 -methyl-adenosine (m6A) in mRNA as a substrate of ALKBH5 was measured. When adipocyte differentiation was induced, the amount of m6A was increased. Also, when the expression of Alkbh5 gene was knockdown, the amount of m6A was further increased. Taken together, the results suggested that ALKBH5 modulated expression of the Cebpβ gene in the early stage of adipogenesis possibly through RNA demethylation and might contribute to lineage decision for white adipocyte browning. This study is the first report showing the role of ALKBH5 in early adipogenesis and its putative mechanism as an epigenetic modulator. ;지방 세포는 에너지 저장소일 뿐 아니라 호르몬 분비를 통해 혈당과 염증 반응을 조절하는 내분비 기관이다. 지방세포의 과도한 축적은 비만 및 당뇨와 같은 만성 질환의 발병과 깊은 상관성을 보이며, 지방 분화가 제대로 일어나지 않을 경우, 각종 대사 질환의 발병률이 높아질 수 있다. 세포의 분화 과정은 후성유전학적 기전에 의해 조절된다 알려져 있지만, 지방 분화에 대한 후성유전학적 기전의 연관성에 대한 연구는 부족하다. 후성유전학적 기전은 DNA의 염기 서열의 변화 없이 유전자의 발현을 조절하는 것을 의미한다. 대표적인 조절 기전엔 DNA, RNA 메틸화와 히스톤 변형이 있다. 지방세포 분화에 대한 히스톤 변형에 대한 연구는 보고된 바 있으나, 핵산의 변형에 대한 연구는 부족하다. 최근 DNA탈메틸화 효소인 TET2 단백질이RNA 안정화나 스플라이싱에 관여하는 RNA 헬리카제, DDX5조절을 통해 지방세포 분화 초기에 중요한 요소로 작용한다고 보고된 바 있다. 그러나 이러한 RNA 조절이 어떻게 지방세포 분화를 유도하는지에 대한 기전은 명확하게 밝혀진 바 없다. 따라서 본 연구에서는 RNA 메틸화 제거에 관여하는 효소인 ALKBH5의 변화가 지방 분화에 어떠한 영향을 미치는 지를 연구하고자 하였다. 이 연구에서 초기 지방 분화에 어떠한 후성유전학적 인자들이 관여하는지 알아보기 위해 이미 발표된 데이터를 2차 가공하여 Differential expression gene Genes (DEGs)과 Gene ontology (GO) term을 통해 분석하였다. 그 결과 지방 분화에 의해 발현이 유의적으로 변화한 유전자들 중 7개의 유전자가 후성유전학적 인자 중 DNA, RNA 메틸화와 직접적으로 관련된 효소인 것을 확인 하였다. 이 중, RNA 탈메탈화 효소 ALKBH5가 분화 초기 시점에서 유의적 변화가 일어나는 것을 확인하고 siRNA를 이용해Alkbh5 유전자 발현을 억제한 뒤 지방 세포 분화에 미치는 영향을 관찰하였다. 결과적으로 Alkbh5 유전자 발현을 억제하고 지방세포 분화를 유도하면, 초기 지방세포 분화가 증진되어PPARg를 비롯한 분화의 분자적 지표들이 증가할 뿐 아니라 이후 중성지방 축적 정도가 증가함을 확인하였다. 특히, ALKBH5가 지방세포 분화 초기에 조절하는 표적 유전자를 살펴보고자 RNA sequencing을 진행하였다. 이를 통해 ALKBH5가 분화 초기 방어 반응과 세포 발달 과정과 같은 다양한 생물학적 경로에 관여함을 확인하였고, 특히 초기 지방 분화 표지인 Cebpβ 유전자의 발현 변화가 가장 큰 유의적 차이를 보였다. 또한 백색 지방조직과 갈색 지방조직의 발현체를 2차 가공 분석한 결과, Cebpβ 유전자의 발현이 백색 지방 조직에서 갈색 지방 조직에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 다음, ALKBH5의 기질이 되는 mRNA의 N (6)-methyl-adenosine (m6A) 양을 측정하였다. 지방세포 분화가 유도될 때 m6A의 양이 증가하였고, Alkbh5 유전자 발현을 억제하였을 때 대조군에 비해 m6A의 양이 더욱 증가하였다. 이러한 결과들을 통해, 초기 지방 분화 시 ALKBH5가 RNA 탈메틸화를 작용을 이용해 Cebpβ 유전자의 발현을 조절하며, 이를 통해 지방선구세포의 운명을 결정하는 데 영향을 줄 수 있음을 보였다. 본 연구결과는 초기 지방 분화의 후성유전적 기전으로 RNA 탈메틸 효소인 ALKBH5의 관련성을 처음으로 보고하고, 이에 대한 기전을 제시하였다는데 의미가 깊다.