Identification and functional characterization of miR-30c-2-3p, miR-218-1-3p and miR-27a-5p as tumor suppressors in lung adenocarcinoma

Abstract

폐암은 기대 수명이 매우 낮은 종양 중 하나이다. 폐암은 non-small cell lung cancer (NSCLC), small cell lung cancer (SCLC)로 분류할 수 있으며, 그 중 NSCLC는 가장 치명적인 암 중의 하나로 사망률과 발생률이 높다. 또한 생존율이 점점 향상되는 다른 종류의 암들과는 달리 폐암의 5년 생존율은 15%로 일정하게 유지되고 있다. 폐암의 높은 사망률의 이유는 폐암 세포의 조직학적 이질성, 조기진단의 어려움 및 치료 효과를 신속하게 평가할 수 없기 때문이다. microRNAs (miRs) 는 17~23개의 nucleotide로 이루어진 small non-coding RNA로 암세포의 성장, 진행 및 전이에 관여하기 때문에 암과 매우 밀접한 관련이 있다. 본 연구에 앞서, 본 연구실에서는 선행 연구로 109명 한국인 폐암 환자의 전사체 데이터를 얻어내었고, 이를 통해 총 2322개의 differentially expressed gene (DEG)의 list를 선발하였다. 그리고 109명의 환자 중 48명의 환자에 대해 miRNA-seq을 수행하여 miRNA의 발현 데이터를 만들었고 miRNA의 정상 조직 대비 암 조직에서 발현 차이가 나타나는 differentially expressed miRNA (DEmiR) 44개를 선별하였다. 44개 중 암 조직에서 발현이 올라간 miRNA가 총 18개였으며, 발현이 내려간 miRNA가 총 26개였다. 문헌 조사 후, 폐암에서 잘 알려지지 않고 암 조직에서 발현이 떨어지는 tumor suppressive miRNA로 예상되는 14개를 추가 선별하였다. 이들에 대해, tumor suppressor로써의 기능 여부를 조사하고자 colony formation assay를 수행하여 5개의 miRNA를 선별하였다. 본 연구는, 이 선행 연구를 바탕으로 tumor suppressive miRNA로써 기능을 하는지 좀 더 깊이 있는 몇 가지 연구를 진행하고자 하였다. 이 miRNA가 target gene에 결합하여 실제로 negative regulation할 수 있는지 조사하기 위해 mRNA 발현 확인 분석과 연결하여 luciferase reporter assay를 수행하였다. 그 결과, miRNA는 3개의 miRNA (miR-30c-2-3p, miR-218-1-3p, miR-27a-5p) 그리고 5개의 target 유전자 (CHPF, SSR2, LIMK1, UGDH, APEX1)을 최종 선별하였다. 이 후, 이 5개의 유전자와 이에 상응하는 3개의 miRNA에 대한 기능 연구를 진행하였다. miR-3oc-2-3p, miR-218-1-3p, miR-27a-5p를 각각 폐암 세포주에 과발현한 후, cell cycle 과 apoptosis 분석하여 각 miRNA가 세포에 어떤 영향을 주어서 세포 성장을 저해시키는지 알아보고자 하였다. 그 결과, miR-30c-2-3p, miR-27a-5p는 G2/M arrest를 유도하며 miR-218-1-3p는 G1 arrest를 유도하였으며 결국 세포의 apoptosis 초래하는 것을 확인하였다. 또한, target gene을 주입하였을 때, miRNA에 의해 저해된 세포 성장이 회복되는지 알아보는 rescue 실험을 진행하였다. 그 결과, 세 miRNA와 각 상응하는 target gene의 rescue 효과를 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해, tumor suppressive miRNA로써 miR-30c-2-3p, miR-218-1-3p, miR-27a-5p의 세포 성장 저해 효과는 충분히 검증이 되었으며, target gene과의 관계 기능 규명은 좀 더 추가적인 연구 결과를 필요로 한다.;Lung cancer is one of the tumors with very low life expectancy. Lung cancers can be classified as either non-small cell lung cancer (NSCLC) or small cell lung cancer (SCLC). NSCLC is one of the most deadly types of cancers with high mortality and incidence. Also, unlike other types of cancers whose survival rates are improving, lung cancer’s 5-year survival rate remains constant at 15%. The high mortality rate of lung cancer is due to the histological heterogeneity of lung cancer cells, the difficulties of early diagnosis and the inability to rapidly assess the effectiveness of treatments. MicroRNAs (miRs) are non-coding RNAs composed of 17 to 23 nucleotides. miRs are very closely related to cancer due to their modulation of cancer-related processes such as angiogenesis, proliferation, apoptosis, cell cycle control, differentiation, migration and metabolism. In the preceding study, 2322 differentially expressed genes (DEGs) were selected from transcriptome of 109 patients through RNA-seq. Also, 44 differentially expressed miRNAs (DEmiRs) showing differences in expression of the miRNA compared with normal tissues were selected from 48 patients out of 109 patients. Out of 44 DEmiRs, 14 novel tumor suppressive miRNAs in lung adenocarcinoma were selected for further study. Colony formation assay, real-time PCR and luciferase reporter assay were performed to validate the tumor suppressive function of candidates and their relationship with potential target genes. Afterwards, the candidate miRNAs were finalized to 3 (miR-30c-2-3p, miR-218-1-3p and miR-27a-5p) and their 5 target genes (CHPF, SSR2, LIMK1, UGDH and APEX1) were cloned for further investigation. Colony formation assay was performed in various lung adenocarcinoma cell lines for additional confirmation of miRNAs’ tumor suppressive activity. After observing decrease in the number of colonies, their effects on cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry. miR-30c-2-3p and miR-27a-5p induced G2/M arrest and miR-218-1-3p induced G1 arrest. The cell cycle arrests eventually led cells to cellular apoptosis. Conversely, when miRNA and target genes were co-transfected, the degraded endogenous gene would be compensated by ectopic expression and therefore the function of the gene could be restored. Indeed, we observed that the colony formation by the cells was restored. Through this study, the cell growth inhibitory effect of miR-30c-2-3p, miR-218-1-3p and miR-27a-5p as tumor suppressive miRNAs was verified. However, identification of the relationship with the target gene requires further study.