Mode of Action Study of Novel DNA Non-intercalative Topoisomerase IIα Catalytic Inhibitors and PARP Inhibitors

Abstract

Part I: Mode of Action Study of Novel DNA Non-intercalative Topoisomerase IIα Catalytic Inhibitors DNA는 복제 시 이중나선의 구조적 특성으로 인해 한쪽이 풀리면 다른 쪽이 더욱더 엉키게 된다. 토포아이소머라아제는 엉킨 부분의 DNA를 단일 가닥 또는 이중 가닥 모두를 절단하고 재연결하여 위상학적인 문제를 해결하는 효소이다. 토포아이소머라아제는 크게 두 가지 종류가 있다. 토포아이소머라아제 I은 DNA 단일 가닥만을 절단하고 재연결해주는 효소이고 토포아이소머라아제 II는 DNA 이중가닥 모두 절단하고 재연결해주는 효소를 의미한다. 사람이 가진 토포아이소머라아제 중 토포아이소머라아제 IIα가 세포주기의 후기 S기 와 G2기에서 과발현 된다. 그러므로 토포아이소머라아제 IIα가 증식단계의 세포에서 과발현 되어있어 빠른 증식을 특징으로 하는 암에서 오래전부터 토포아이소머라아제 IIα를 표적으로 한 항암 연구가 활발히 진행되어왔다. 토포아이소머라아제 억제제로는 독성억제제와 촉매억제제로 나뉘어진다. 독성억제제는 토포아이소머라아제 II의 촉매주기 중 DNA가 절단된 후 재연결되는 단계를 차단함으로써 토포아이소머라아제 II의 활성을 차단한다. 독성 억제제는 절단된 DNA 토포아이소머라아제 복합체를 안정화 시키기 때문에 비정상적으로 절단된 DNA 축적을 야기함으로써, 독성이 나타나게 되어, 여러 부작용이 발생한다. 이와 달리 촉매억제제는 독성억제제가 작용하는 부분을 제외한 나머지 부분의 촉매 주기를 억제하기 때문에 DNA 손상이 독성억제제보다 적어 부작용을 최소화할 수 있다. 아직 독성억제제만큼 강한 항암효과를 보이는 촉매억제제가 발견되지 않았기 때문에 이미 알려진 촉매억제제가 존재하지만 임상에서는 독성억제제가 많이 사용되고 있다. 따라서 우리는 독성억제제만큼 활성이 좋은 촉매억제제를 만들기 위해 연구를 진행하였다. 먼저 영남대학교 이응석 교수님으로부터 제공받은 36개의 화합물들이 토포아이소머라아제 IIα를 억제하는지, 그리고 항증식활성이 있는지 확인하였다. 그 결과, AK-I-190과 AK-I-191이 토포아이소머라아제 IIα의 활성을 저농도에서도 강한 억제활성을 보였다. AK-I-190은 전립선암 세포에서, AK-I-191은 유방암 세포에서 항증식 활성이 강했기 때문에 이 두 화합물의 토포아이소머라아제 IIα 억제 작용기전과 세포에서 미치는 영향을 확인하기 위해 추가적인 실험들을 각각의 세포주에서 진행하였다. kDNA decatenation assay를 통해 topoisomerase IIα를 억제한다는 것을 검증하였으며 cleavage complex assay, band depletion assay, comet assay로 두 화합물이 촉매억제제인 것을 확인하였다. DNA unwinding assay, EtBr displacement assay로 화합물이 DNA에 삽입되지 않는 것을 확인함으로써 화합물이 DNA에 삽입제로서 토포아이소머라아제를 억제 시키지 않는 것을 확인하였다. 또한 이 두 화합물을 처리한 세포주에서 FACS와 western blot analysis를 통해 AK-I-190과 AK-I-191 모두 G1 arrest를 일으켜 세포사멸을 유도하는 topoisomerase IIα 억제제인 것을 확인하였다. Part II: Mode of Action Study of PARP inhibitors DNA의 손상은 유전적 변이를 일으켜 암과 종양의 성장을 촉진시킨다. BRCA는 상동재조합에 관여하는 암 억제 단백질로, DNA 손상을 수리하여 세포의 유전물질을 안정화 시켜 암 발생을 억제할 수 있다. BRCA 유전자에 돌연변이가 생기면 상동재조합에 의한 DNA 수리가 불가능하여 유전적 변이를 일으키기 때문에 BRCA 유전자가 정상인 사람보다 유방암이나 난소암의 발병률과 치료 후의 재발률이 높다. 특히 BRCA 유전자에 돌연변이가 생긴 유방암환자들의 약 70%가 삼중 음성 유방암에 해당한다. 삼중 음성 유방암은 예후가 좋지 않으며 재발률이 높은 암이다. 삼중 음성 유방암은 에스트로겐 또는 프로게스테론 수용체가 음성이며 인간상피 성장인자 수용체 2형인 HER2 유전자의 과발현이 되어 있지 않은 유방암의 한 종류로 항암제에 일부 반응하더라도 재발이 빨라서 치료가 어려운 암이다. BRCA 유전자에 돌연변이가 생긴 삼중 음성 유방암의 경우 상동재조합 수리 작용이 제대로 일어나지 못하기 때문에 DNA 손상에 관여하는 단백질을 표적으로 한 항암제에 더 민감 할 수 있다. DNA에 손상에 관여하는 대표적인 단백질로 PARP가 있다. DNA에 단일 가닥 손상이 일어났을 때 PARP1과 PARP2가 작용한다. PARP1이 DNA 단일 가닥 손상을 인식하고 DNA 단일 가닥 손상부분에 결합한다. NAD+를 이용하여 PARP1은 poly ADP ribose를 합성하여 PARP와 XRCC1 등의 수리에 관여하는 단백질복합체를 DNA 손상 부분에 모집시킨다. 그 이후에 FEN1과 PARP2가 활성화되어 DNA 단일 가닥 부분에 수리되는 정도를 조절해준 후 수리가 완료되면 DNA에서 방출된다. 그러므로 DNA 손상을 수리하는 단백질인 PARP를 막는 PARP 억제제는 BRCA 유전자에 돌연변이가 생긴 삼중 음성 유방암에서 강한 항암효과를 일으킬 수 있어 PARP 표적 치료제가 효과가 있다는 연구결과가 최근에 밝혀지고있다. 또한 PARP 억제제는 다른 항암제 보다 부작용이 낮아 항암치료제로서 더 선호되고있다. FDA에 승인되어 임상에서 사용되는 PARP 억제제로는 olaparib, rucaparib, niraparib 등이 있다. 임상에 사용되는 PARP 억제제는 BRCA 유전자가 돌연변이가 생긴 유방암이나 난소암에서 주로 사용되는데 용해성의 문제와 PARP2를 같이 억제함으로써 발생하는 LDL 콜레스테롤의 축적과 HDL 콜레스테롤 수치 감소의 부작용이 있기 때문에 이를 해결할 수 있는 새로운 PARP 억제제 개발을 연구하고자 한다. 차의과대학교 나영화 교수님으로부터 제공받은 새로 합성된 8개의 화합물의 PARP 활성 억제정도를 확인하였으며 HT-I-138이 3-aminobenzamide보다 더 강하게 PARP를 억제함을 확인했다. 추가적인 실험으로 화합물이 다양한 세포에서 PARP의 활성을 저해하는지 여부를 결정하기 위해 PARP가 활성화되어 합성되는 세포 내 poly ADP ribose의 단백질 발현 정도를 확인할 것이며 BRCA 유전자가 돌연변이 된 삼중 음성 유방암 세포에서 강한 항증식성을 보이는 것을 확인할 것이다. 또한 PARP 억제제 단독으로 투여했을 때보다 시스플라틴과 같은 DNA에 손상을 주는 항암제와 병용처리시 PARP 억제제의 항증식 효과가 극대화되는지 여부를 결정하기 위한 실험을 수행 할 것이다.;Part I: Mode of Action Study of Novel DNA Non-intercalative Topoisomerase IIα Catalytic Inhibitors Topoisomerases are critical enzymes that solve topological problems through the cleavage and relegation of one or both strands during DNA replication, transcription, and chromosome segregation. In humans, the classes of topoisomerases are: topoisomerase I, topoisomerase IIα, or topoisomerase IIβ. Among these topoisomerase classes, only topoisomerase IIα protein expression changes according to the proliferative phase of the cell, where it is overexpressed in the late phase S and G2/M phases of the cell cycle. Therefore, DNA topoisomerase IIα has been used as important target in cancer therapy for a long time. Topoisomerase II inhibitors are generally categorized into two groups: topoisomerase II poisons and topoisomerase II catalytic inhibitors. Etoposide and doxorubicin are well known topoisomerase II poisons. These inhibitors stabilize DNA-topoisomerase II complexes by blocking the steps after cleavage of the DNA, thereby increasing DNA double-strand breaks which cause side effects. Conversely, the catalytic inhibitors do not stabilize the DNA cleavage complex, because they block the enzyme before DNA cleavage or in the last step of the catalytic cycle after relegation. Hence, they are less damaging to DNA than poison inhibitors. Therefore, we have searched for potent topoisomerase IIα catalytic inhibitors. To develop a strong topoisomerase IIα catalytic inhibitor, we evaluated the behavior of 36 newly synthesized compounds in an in vitro topoisomerase relaxation assay and their effects on the viability of human cancer cells. Through these experiments, we have chosen two compounds with powerful topoisomerase IIα inhibitory activity and high anti-proliferative activity in cancer cell lines. The topoisomerase IIα inhibitory mechanisms of these compounds were determined through various experiments, such as the DNA cleavage complex assay, the band depletion assay, the comet assay, the EtBr displacement assay, and the kDNA decatenation assay. Furthermore, we conducted FACS analysis and western blotting to confirm the efficacy of these compounds for the induction of apoptosis and cell cycle arrest. Conclusions. AK-I-190 and AK-I-191 were revealed as DNA non-intercalative topoisomerase IIα catalytic inhibitors that induced G1 arrest and apoptosis. Part II: Mode of Action Study of PARP inhibitors BRCA is a protein involved in homologous recombination repair that can repair DNA double strand breaks. DNA double strand breaks may cause cancer and uncontrolled growth of tumors. BRCA stabilizes cell genetic material and prevents cancer by repairing DNA double strand breaks. For this reason, the BRCA gene is a tumor suppressor gene. When BRCA mutates, it cannot restore DNA to homologous recombination and causes genetic mutations. Thus, people with BRCA mutation have a higher incidence of breast cancer or ovarian cancer than those with normal BRCA and have a higher probability of recurrence after treatment. About 70% of breast cancer patients with this BRCA mutation belong to a type triple negative cancer cell. Triple negative cancer cell is a cancer with poor prognosis and high recurrence rate. Triple negative cancer cell has no hormone receptors such as androgen and progesterone receptors and human epidermal growth factor receptor 2, thus making it difficult to be treated. Recently, however, PARP target therapy has been shown to be effective in BRCA mutant triple negative cancer cell. Abnormally rapid proliferation of malignant cancer cells causes considerable DNA damage. The most common type of DNA damage is single strand break (SSB), which occurs at 10,000 frequencies every day. Although DNA damage causes cell death, cancer cells do not, because cancer cells can repair it with a self-repair mechanism. However, cancer cells with BRCA mutations are more sensitive to anticancer drugs targeting proteins associated with DNA damage due to the difficulty of DNA repair. Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) is a protein associated with DNA damage. PARP is a nuclear enzyme that recognizes DNA damage site when SSB occurs. When PARP detects SSB, PARP initiates synthesis of poly (ADP- ribose) using NAD + and recruits proteins involved in repairs. When DNA is recovered by the proteins involved in the repair, PARP is released from DNA. PARP inhibitors that block damaged DNA repair can effectively treat BRCA mutant triple negative cancer cell. In addition, PARP inhibitors are preferred anticancer drugs because they have fewer side effects than other anticancer drugs. Olaparib, rucaparib, and niraparib are FDA-approved PARP inhibitors currently used in clinical practice. These PARP inhibitors are mainly used in BRCA-mutated breast cancer and ovarian cancer. However, PARP inhibitors such as olaparib, rucaparib and niraparib have low solubility problem in water and side effects due to inhibition of PARP2. In the current study, we evaluated PARP inhibitory activity of newly designed and synthesized 8 compounds using Universal Chemiluminescent PARP Assay kit. In order to verify that the kit worked properly, we measured the concentration of the well-known PARP inhibitors, olaparib and 3-aminobenzamide which inhibited 50% of PARP activity. The inhibitory concentrations of these two inhibitors obtained using the kit were similar to the known IC50 values. Thus, the PARP inhibition concentrations of the eight compounds were determined using the kit. Among the eight synthesized compounds tested, HT-I-135, HT-I-136, HT-I-137 and HT-I-138 showed better IC50 values than 3-aminobenzamide. It was also confirmed that HT-I-138 inhibited the activity of PARP in BRCA mutant triple negative breast cancer cells. We will study the efficacy of HT-I-138, which inhibited the most potently PARP activity among the eight compounds in BRCA-mutant triple negative cancer cell.