Effects of Pharmaceutical Excipients and Fluidizing Agent on Efflux Transporters

Abstract

Efflux transporters are reportedly one of the main causes of multi-drug resistance (MDR). The oral bioavailability of topotecan (TPT) and mitoxantrone (MX), dual P-glycoprotein (P-gp) and breast cancer resistance protein (BCRP) substrates, is affected by efflux transporters present in the gastrointestinal (GI) tract which limit drug absorption. The aim of this study was to investigate the effects of membrane fluidizing agent, benzyl alcohol and pharmaceutical excipients, tween 80 and vitamin E TPGS on efflux transporters. In order to evaluate the effects of pharmaceutical excipients and membrane fluidizing agent on P-gp and BCRP, intracellular accumulation of MX in MDR cells (P-gp or BCRP overexpressed cells) was tested by using Flow cytometry. The high-performance liquid chromatography-fluorescence method was validated and applied to determine the plasma concentrations of TPT after intravenous (4 mg/kg) or oral (40 mg/kg) administration of the drug with or without tween 80 and vitamin E TPGS. Co-treatment with MX and tween 80 led to the increased accumulation of MX in MDR cells. The accumulation of MX was significantly changed by treatment with benzyl alcohol, which makes the membrane more fluid, but there was no effect with cholesterol, which has the opposite effects on the membrane as benzyl alcohol. Although the AUC0->t and Cmax values of TPT were not significantly altered in the presence of 1% tween 80 and 50 mg/kg vitamin E TPGS, those pharmacokinetic values were significantly increased when animals were administered with 40 mg/kg TPT and 2.5% tween 80. These results suggest that membrane fluidization significantly affect the efflux of P-gp and BCRP substrate drugs. Although vitamin E TPGS had insignificant effects on the pharmacokinetics of TPT, tween 80 might affect the functions of P-gp and BCRP in a dose-dependent manner.;다약제 내성의 주요 원인으로 알려진 배출수송체인 P-당단백질과 유방암 저항 단백질의 이중 기질인 토포테칸과 미톡산트론은 이들 배출수송체에 의해 흡수가 저해된다. 따라서 위장관에서의 약물 흡수를 억제하는 배출수송체의 활성을 저해함으로써 배출수송체의 기질 약물들의 경구흡수율을 증가시키는 연구가 진행되고 있다. 또한, 생체막의 유동성 변화가 여러 약물 또는 생체에 필요한 성분들의 생체막 투과에 영향을 미친다는 것이 보고되었다. 이와 더불어 의약품 제조에 첨가되는 여러 성분들이 다양한 수송체 활성에 영향을 미친다는 것도 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 생체막의 유동성을 증가시키는 벤질 알코올과 난용성 약물의 용해도를 높이기 위해 첨가되는 트윈 80과 비타민 E TPGS 가 위장관 내 존재하는 대표적인 배출 수송체인 P-당단백질과 유방암 저항 단백질에 미치는 영향을 조사하고, 이들의 활성을 억제함으로써 기질 약물인 토포테칸과 미톡산드론의 경구흡수율을 증가시킬 수 있는지를 세포 수준과 동물모델에서 확인하고자 하였다. 먼저 웨스턴 블로팅과 세포독성 실험을 통해 각 내성암세포에서 P-당단백질 및 유방암 저항 단백질이 과발현된 것을 확인하였다. 이들 세포를 의약품 첨가제와 벤질 알코올로 처리함으로써 내성암세포에서의 미톡산트론 축적 변화를 유세포 분석으로 확인하였다. 또한 기 확립된HPLC-형광분석법의 특이성, 직선성, 정밀성 및 정확성을 검증하였고 이를 활용하여 동물실험 후 얻은 혈장 내 토포테칸의 농도를 검출하였다. 미톡산트론을 트윈 80과 함께 처리하면 내성암세포에서의 미톡산트론 축적이 증가하였고 막을 유동화시키는 벤질 알코올 역시 유의하게 미톡산트론의 배출을 저해하여 미톡산트론의 세포 내 축적을 증가시켰다. 벤질 알코올과는 달리 생체막의 유동성을 감소시키는 것으로 알려진 콜레스테롤을 세포에 처리했을 때 미톡산트론 축적에 유의한 변화는 나타나지 않았다. 1%의 트윈 80과 50 mg/kg비타민 E PTGS를 토포테칸과 함께 동물에 병용 투여하였을 때, 약동학적 파라미터의 변화가 유의하지 않은 반면, 2.5%의 트윈 80과 병용 투여한 실험군의 경우 토포테칸의 생체이용률이 통계적으로 유의하게 약 1.8배 증가하였다. 따라서 벤질 알코올에 의한 생체막 유동화를 통해 P-당단백질과 유방암 저항 단백질 이중 기질 약물의 위장관 내로의 배출을 억제하여 이들 약물의 경구흡수율을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다. 트윈 80또한 벤질 알코올과 마찬가지로 농도 의존적으로 이들 배출 수송체의 활성을 억제함으로써 기질 약물들의 위장관 흡수를 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 결론적으로 본 연구를 통해 생체막 유동성이 P-당단백질과 유방암 저항 단백질의 활성에 영향을 미쳐 기질 약물들의 경구 흡수율 및 약동학적 파라미터들을 변화시킬 수 있음을 확인하였다.