Differential protective effects of exenatide, a GLP-1R agonist, and piragliatin, a glucokinase activator, under ER stress in pancreatic beta cells

Abstract

제2형 당뇨는 인슐린 분비나 인슐린 작용에 문제가 생겨 고혈당을 나타내는 질환으로, 지속적으로 췌장베타세포 감소가 진행되는 진행성 질환이다. 췌장베타세포는 지속적인 고혈당이나 비만으로 인해 증가한 혈중 유리지방산 등이 유발하는 산화적 스트레스나 소포체스트레스로 인해 세포사멸을 나타낸다. 소포체 스트레스와 2형 당뇨와의 연관성에 대해서는 많은 연구결과가 보고되어 있으며, 최근 지속적 고혈당에 의한 세포사멸과정에서도 소포체 스트레스가 관여한다는 보고가 있어서 2형 당뇨에서 소포체 스트레스에 의한 베타세포 사멸이 많은 주목을 받고 있다. 따라서, 혈당을 낮출 뿐 아니라 베타세포보호효과를 통해 췌장베타세포가 감소하는 것을 막을 수 있는 약제가 2형 당뇨를 효과적으로 조절할 수 있겠다. 이 두 가지 효과를 모두 나타내는 약제로서 현재 임상에 적용되는 대표적 약제가 exenatide라는 glucagon-like peptide (GLP)-1유사체이다. Glucokinase는 간과 췌장 베타세포에서 세포로 유입된 포도당을 인산화시켜 해당작용으로 진입할 수 있도록 해주는 효소이며, 저분자 화합물로서 glucokinase의 allosteric site에 결합해서 glucokinase의 포도당에 대한 친화도를 높여주는 약물을 glucokinase activator (GKA)라고 하는데 베타세포에서 인슐린 분비를 촉진하고 간에서 포도당이용을 증가시켜 항당뇨효과를 나타낸다. Glucokinase activator의 베타세포 보호효과에 대한 연구결과도 발표된 바 있으며, glucokinase가 포도당이용을 증가시키면 Insulin substrate-2 (IRS-2) 발현을 증가시켜 베타세포증식이 증가한다는 개연성도 보고된 바 있다. 그러나, 베타세포에서 일어날 수 있는 주요 스트레스 중에서 소포체 스트레스에 대한 GKA의 약효는 보고된 바 없다. 본 연구의 첫 번째 부분에서는 랫트의 베타세포종양세포주인 INS-1세포에 인슐린 분비 증가를 유도하는 서로 다른 두 기전의 항당뇨약제를 처리해서 streptozotocin (STZ)에 의한 산화적 스트레스와 palmitic acid 또는 thapsigargin (Tg)에 의해 소포체 내부의 칼슘이 고갈되면서 나타나는 소포체 스트레스 조건하에서 약물에 따른 베타세포 보호효과에 대해 연구했다. 임상 2상에서 개발 중단된 GKA인 piragliatin과 임상에서 적용되고 있는 GLP-1R agonist인 exenatide의 비교실험 결과, exenatide는 산화적 스트레스 및 소포체스트레스 조건에서 효과적으로 베타세포의 사멸을 억제한 반면, piragliatin은 STZ에 의한 세포사멸은 억제했으나 소포체 스트레스 유발 베타세포 사멸에는 유의적인 영향을 나타내지 않았다. Exenatide와는 다른 piragliatin의 작용은 세포 내 포도당 이용을 높여주는 약물기전에 기인한 것이었으며, exenatide는 Akt활성화가 두 스트레스 조건에서 공통적으로 관찰된 작용기전이었고 소포체 스트레스 하에서는 JNK활성화 억제가 추가적으로 기여하는 것으로 확인되었다. 보다 확장된 조건에서 약물의 차별화된 반응성의 요인을 찾고자 프로테옴 분석을 실시한 결과, 베타세포의 사멸에서 특이적으로 나타나는 14-3-3β, ε, θ의 단백질 spot을 발견했고, 이 spot이 전사 후 조절작용에 따른 단백질 변형에 의해 나타나는 것으로 14-3-3 단백질을 인산화 시킨다고 보고된 JNK에 의한 인산화는 아님을 확인했다. 더불어 이 과정에서 14-3-3θ의 단백질 양이 세포사멸이 일어난 조건에서는 감소한다는 연관성을 발견했고, 14-3-3θ의 siRNA를 이용해 단백질발현을 감소시켰을 때 소포체 스트레스에 더 민감해 진다는 실험결과를 통해 14-3-3θ의 췌장 베타세포의 생존에 대한 영향을 최초로 규명했으며, exenatide가 14-3-3θ의 단백질 양 보존과 전사 후 조절작용에 의한 인산화를 차단하는 작용을 통해 베타세포 보호효과를 매개함을 처음으로 제시했다. 두 번째 부분에서는 비교프로테옴분석을 통해 소포체 스트레스 조건에서 변화하는 단백질에 대한 exenatide의 영향을 연구했다. 프로테옴 분석결과 thapsigargin처리에 의해 1.2배 이상 증감하는 58개의 단백질 spot을 찾았으며, 주로 단백질 및 핵산의 대사에 관련된 단백질이었으나, 가장 높은 변화를 나타낸 것은 세포신호전달 및 단백질이동에 관여하는 14-3-3단백질 중 14-3-3β, ε, θ였다. 변화하는 단백질에 대해 exenatide는 31종의 단백질 및 핵산 대사관련 단백질의 증감을 대조군 수준으로 유지시켜 변화를 차단함을 나타냈으며, 5개는 오히려 소포체 스트레스에 의한 감소를 더욱 증가시켰다. Exenatide에 의한 변화가 차단된 단백질 중 14-3-3의 변화가 가장 현저하며 소포체 스트레스에 의한 신호전달에 관여하는 scaffold단백질이므로, 이후 연구를 14-3-3단백질에 집중하게 되었다. 본 연구에서 2D gel상에 나타난 모든 14-3-3을 동정한 결과 총 16개의 단백질 spot을 확인했으며, 총 7개의 isoform중 14-3-3σ를 제외한 6종의 isoform으로 16종 spot의 전사 후 변형을 모두 LC/MS/MS분석으로 동정하여 최종적으로 14-3-3θ의 92번 Serine의 인산화가 스트레스에 의해 나타나는 변화임을 확인했다. 이 인산화에 기여했을 가능성이 있는 인산화 효소를 소프트웨어를 이용해 예측한 결과 CaMK1a가 가장 높은 점수로 예측되었다. 본 연구결과를 통해 베타세포에서 일어나는 소포체 스트레스 조건에서 14-3-3 isoform의 변화를 최초로 확인했으며, 14-3-3θ의 인산화 site를 동정했다. 소포체 스트레스에 의해 유도되는 14-3-3θ의 인산화는 exenatide처리에 의해 완전히 차단됨을 제시하였다. 두 부분의 연구결과의 의미를 종합하면, 서로 다른 약물타겟을 대상으로 하는 인슐린분비 촉진제인 piragliatin과 exenatide가 베타세포보호효과의 차이를 통해 2형 당뇨진행에 대해서는 exenatide가 piragliatin대비 차별화된 약효를 가지며, 14-3-3θ단백질의 양과 Ser92 의 인산화가 스트레스 특이적으로 변화하고 이런 변화가 exenatide에 의해 완전히 차단됨을 보여 exenatide의 베타세포사멸 억제효과에서 14-3-3θ의 새로운 역할을 제시했으며, 이는 베타세포에서 14-3-3θ의 isoform특이적 변화 및 작용에 대한 최초 보고이다.;Type 2 diabetes is a progressive disease caused by reduced insulin secretion due to beta cell dysfunction and reduced insulin action. Pancreatic beta cells are known to be vulnerable to oxidative stress and endoplasmic reticulum (ER) stress because they have low levels of antioxidant enzymes and they have to continuously secrete insulin from protein synthesis. Recent studies have reported that ER stress plays a key role in the pathogenesis of type 2 diabetes. This study intended to investigate how two antidiabetic agents, exenatide (a DPP4-resistant GLP-1R agonist) and piragliatin (a glucokinase activator), differently act on beta cell death via on different molecular targets, even though these are same insulin secretagogues. Rat insulinoma cell line (INS-1) was used as a cell source, which is known to be sensitive to ER stress due to lower capacity of chaperon proteins compared to other beta cell line such as MIN-6. PART I presents differential effect of exenatide and piragliatin on oxidative- and ER stress-induced beta cell death. The results suggest that the protective effect of piragliatin under streptozotocin (STZ)-induced stress may be attributed to enhanced glucose utilization through activating glucokinase. On the other hand, the protective effect of exenatide is caused mainly by Akt activation under STZ-induced and ER stresses, and with additional JNK inhibition under ER stress. Piragliatin, however, had no discernible effect on the activation of Akt and JNK under ER stress condition. The role of p38 kinase in drug effect was not detected in this experimental condition. Comparative proteomic analyses were employed to identify the differential protein changes in response to control, death inducer only, death inducer plus exenatide, and death inducer plus piragliatin. Cell lysates obtained from each treatment, were separated on two-dimensional gel electrophoresis, differentially expressed spots were detected with repeated experiments using image analysis software and each spot was identified by tandem MS analysis. The results suggested that 6 proteins are altered in accordance with the beta cell survival or death: metabolic enzymes such as two spots of thimet oligopeptidase and one of GMP synthase disappeared or reduced according to beta cell death. Other new spots appeared in response to beta cell death were identified as three phosphorylated forms of 14-3-3 scaffold proteins (β, θ, and ε). These phosphorylations are revealed as independent of JNK activity. Moreover, these results demonstrate that the protein levels of 14-3-3θ have a negative correlation with sensitivity to ER stress-induced beta cell death, suggesting a potential role of 14-3-3θ in beta cell survival. PART II presents the proteins which were identified combining separation on 2D-PAGE and protein sequencing with tandem MS, in response to the treatment of beta cells with control, thapsigargin, or combination of thapsigargin and exenatide. Fifty eight protein spots altered by thapsigargin were identified: 44 spots of them including metabolic enzymes and structure proteins were significantly down-regulated and 14 spots including heat shock proteins, 14-3-3β, θ, and ε protein spots were significantly up-regulated by thapsigargin. Of these, 31 spot changes caused by thapsigargin were completely recovered to the control level by exenatide treatment, and the changes of 5 spots were significantly changed in a same way with thapsigargin. Most significant changes detected under ER stress and exenatide treatment among them are protein 14-3-3. This study focused on changes of 14-3-3 proteins in response to exenatide. Recent study reported that the sustained effect of GLP-1R agonists on beta cell apoptosis is mediated by the interaction of 14-3-3 proteins to phosphorylated BAD. However, no 14-3-3 isoform studies were done and it is not known how 14-3-3 is modified depending on the stress signals. 14-3-3 proteins was first identified from bovine brain and named from their migration position. Although 7 isoforms of 14-3-3 family are identified and their various bindings to phophoproteins are known, specific modifications of these isoforms are limited. In this study, all post-translational modifications of 14-3-3 spots were determined using powerful tandem MS proteomic tools in response to thapsigarin and exenatide. Six of total seven 14-3-3 isoforms in 16 differentially appeared protein spots were identified with their modifications and confirmed whether the appearance of those spots come from by PTM or not. Finally, only phosphorylation of 14-3-3θ at Ser92 is found to contribute to the differential appearance according to thapsigargin treatment. The results suggest the role of this modification of 14-3-3θ in the beta cell protective effect of exenatide treatments. Collectively, the differential protective effects of exenatide and piragliatin on the progressive deterioration of type 2 diabetes were demonstrated, In addition to comparative proteomic analysis, novel role of 14-3-3θ in beta cell survival depending on its protein level and posttranslational modification is discovered. The results demonstrate the possibility that the blocking this 14-3-3θ specific modification and lowering protein level contribute to the beta cell protective effect of exenatide.