Necrotic cells influence migration, invasion and miRNA-mRNA association in glioblastoma cells

Abstract

Grade Ⅳ astrocytoma, also called glioblastoma multiforme (GBM), is considered as the most malignant glial tumor. The purpose of my study is to understand the molecular mechanisms underlying the signaling network between necrotic tissues and GBM cells by exploring the effect of necrosis on GBM migration, invasion and miRNA-mRNA association. The migration and invasion of the CRT-MG human astroglioma cells were significantly enhanced by treatment with necrotic cells, as shown by assays for scratch wound healing and spheroid invasion. Incubation with necrotic cells induced IL-8 secretion in CRT-MG in a dose-dependent manner. Immunohistochemical and immunofluorescen -ce analysis for IL-8 in human GBM tissues showed that positively stained cells were mainly distributed in perinecrotic region. Necrotic cells induced NF-κB and AP-1 activation and their DNA binding to IL-8 promoter, leading to enhanced IL-8 production and secretion in GBM cells. To determine the effect of necrosis on the miRNA profiles and regulatory relationship, the expression profiles of miRNA and mRNA and association between mRNA and their corresponding miRNAs were analyzed by next-generation sequencing. The necrotic cells induced dysregulation of 106 miRNAs and 887 mRNAs. Among them, 11 miRNAs that had a negative correlation value of p < 0.05 by the hypergeometric test were screened, and their target mRNAs were analyzed by Gene Ontology enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database. Several necrotic cell treatment-activated pathways were found by KEGG database analysis, which were modulated by relevant gene targets of differentially expressed miRNAs. These results demonstrate that necrotic cells enhance the migration and invasion of GBM cells through NF-κB/AP-1/IL-8 signaling pathway and induce dysregulation of miRNA and mRNA expression profiles in GBM cells.;성상세포종 4기인 교모세포종은 성인의 뇌에서 일차적으로 발생하는 가장 흔한 신경교종이다. 이 연구의 목적은 교모세포종 세포가 괴사세포에 노출되었을 때, 세포의 이동, 침윤, miRNA-mRNA 상관관계에 괴사세포가 어떠한 영향을 미치는가를 확인하고, 괴사세포와 암세포 사이에서의 신호전달 네트워크의 분자적매커니즘을 이해함에 있다. 괴사세포를 처리하였을 때, 교모세포종의 세포이동과 침윤이 증가함은 wound healing assay와 spheroid invasion assay를 이용하여 확인하였고, 괴사세포 처리 정도에 따라 IL-8의 발현이 증가함을 확인하였다. 괴사세포 처리에 따른 IL-8의 발현 증가는 교모세포종 환자조직에서도 확인되었다. 괴사세포 처리시 교모세포종 내 전사인자인 NF-κB와 AP-1이 활성화되고 이를 통해 IL-8의 단백질과 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 괴사세포를 처리한 세포와 처리하지 않은 세포 사이에서 miRNA와 mRNA의 발현 차이와 mRNA-miRNA의 음의 상관관계를 next-generation sequencing (NGS) 분석기법을 통하여 확인하였다. 괴사세포에 의해 106개의 miRNA와 887개의 mRNA 발현차이를 확인하였다. 그 중에서 11개의 miRNA만이 hypergeometric test을 통해서 유의성 있는 (p <0.05) 음의 상관관계를 가진다는 것을 확인하였고, 11개의 miRNA의 표적 mRNA에 대하여 Gene Ontology enrichment와 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 데이터 베이스를 기반으로 분석하였다. 그 결과 miRNA 발현차이에 의한 표적 mRNA 조절을 통해 괴사세포 처리 후 활성화되는 신호전달과정을 확인 하였다. 본 연구를 통해, 괴사세포에 노출된 교모세포종에서 NF-κB/AP-1/IL-8 신호전달 경로를 통해 암세포의 이동과 침윤이 증가한다는 것을 확인하였고, 괴사세포에 의한 교모세포종 내 miRNA와 mRNA의 발현 변화가 유도됨을 확인하였다.