Rescuing effects of A3 adenosine receptor agonist on glutamate-induced neurotoxicity in vitro and scopolamine- or streptozotocin-treated memory impairment in vivo

Abstract

Extracellular adenosine has shown a wide range of physiological actions by coupling to multiple GPCR adenosine receptor subtypes (A1, A2A, A2B and A3ARs), and adenosine signaling has known to be largely enhanced during the pathological conditions such as ischemic injury, inflammation or cancer progression. A3AR, in particular, has been discovered to contribute largely to cardioprotection, anti-inflammation, anti-cancer. However, roles of A3AR in the brain are still not understood well, even though considerable interest has recently been being gathered to its involvement in normal and pathological conditions of the CNS. Especially the functional role of A3AR in terms of neuroprotective vs. neurotoxic actions has been controversial, and moreover its role on the cognitive dysfunction in Alzheimer’s disease (AD) is almost unknown. A previous study in our lab has demonstrated that A3AR agonists, thio-IB-MECA (LJ-529) and IB-MECA, increased the sAPPα release through non-amyloidogenic pathway known to restrict Aβ formation. Present study, thus, pursued for the protective effects of the A3AR agonists against neurotoxicity and memory defect, representative events in AD. First it was found that both LJ-529 and IB-MECA dose-dependently reversed the glutamate-induced neurotoxicity in murine hippocampal HT22 cells, known to possess high sensitivity in ROS generation. Next, the significant blocking effects of LJ529, a recently developed A3AR agonist, against intracellular ROS accumulation and the ROS-induced concomitant lactate dehydrogenase release were further demonstrated. These results strongly imply the neuroprotective and antioxidant abilities of A3AR agonists. Then, to investigate the in vivo behavioral change in memory, LJ529 was orally administered with 3 different doses to scopolamine-induced memory deficit mice, and changes among groups were examined with passive avoidance tasks. Tasks were operated in 3 different methods. In all 3 methods, LJ529 significantly improved the scopolamine-induced memory impairment in a dose-dependent manner regarding to the mean latency time of retention trials. LJ529 also showed an acute protective effect as much as donepezil in 1 hour-interval trial. Chronic administration not only ameliorated scopolamine-induced memory impairments, but also improved the memory of normal control, implying the memory reinforcing role of LJ529. In addition, to further investigate the therapeutic potential of LJ529, experimental sporadic AD model was introduced by intracerebroventricular administration of streptozotocin (STZ) to rats. LJ529 or donepezil was orally administered daily from 14th to 33th days after the first STZ injection. Changes in memory were detected with passive avoidance tasks on 22th and 23th day from the first STZ injection. Latency times among control and treatment groups were recorded with significant difference, which implied that LJ529 had recovered STZ-induced AD pathologies. Finally, the validity of the newly adopted animal model of sporadic AD was partly confirmed by observing changes of p-IRS and GSK-3β in 3 separate tissue regions. p-IRS level was regarded on behalf of total-IRS level changes. Taken together, data in this study imply that LJ529, an A3AR agonist, could be promising enough to be suggested as a novel preventive and therapeutic drug candidate for AD, although precise mechanisms for its neuroprotective and memory enhancing functions remain to be further elucidated.;아데노신은 여러 GPCR 아데노신 수용체 아형들(A1, A2A, A2B, A3AR)에 결합하여 광범위하게 정상생리를 조절하며, 허혈성 손상, 염증, 암의 진행 등의 질병상태에서도 아데노신 신호전달계가 크게 활성화된다고 알려져 있다. A3AR은 특히 심장보호, 항염증, 항암작용에 관여함이 많이 밝혀져 있다. 그에 비해 중추신경계의 정상 및 병태 생리상태에서의 A3AR의 역할에 대해서 상당한 관심이 집중되고 있음에도 불구하고 확실하게 규명되어 있지 않다. A3AR의 역할은 신경보호와 신경독성의 두 가지 상반된 측면에서 논란이 있으며, 알츠하이머성 치매의 인지능력이상에서의 기능은 거의 연구된 바가 없다. 본 실험실의 이전 연구에서 Aβ 형성을 제한하는 non-amyloidogenic 경로의 산물로서 신경보호기능을 지닌다고 알려진 sAPPα 분비가 A3AR 효능제인 LJ-529와 IB-MECA에 의해 증가됨을 관찰한 바 있어, 이 연구에서는 신경독성과 기억손상에 있어서의 A3AR 효능제의 보호적 역할을 밝히고자 하였다. 먼저, 활성산소종 발생에 민감한 생쥐 해마 유래 HT22 세포주에서 glutamate 처리로 유도된 신경독성이 LJ529와 IB-MECA에 의해 농도의존적으로 억제됨을 관찰했다. 그와 더불어 glutamate 처리로 인해 축적된 활성산소종과 그 때 유리되는 lactate dehydrogenase를 유의하게 저해시킴을 보임으로서, A3AR 효능제의 항산화적 신경보호작용을 확인했다. 이어서 기억에 의한 행동에 대한 영향을 조사하기 위해 LJ529를 생쥐에 scopolamine 투여로 인한 기억손상 유도 전 세 농도로 경구투여 하여 수동회피실험을 이용하여 기억행동 변화를 측정하였다. Scopolamine 투여 1시간 및 24시간 후 측정된 retention trial에서의 평균 지연시간을 비교했을 때, LJ529 투여 군에서 기억 손상을 농도 의존적으로 개선시켰고, donepezil 수준과 유사한 효과를 보였다. 또한 6일간 반복 투여 시 scopolamine에 의한 기억손상을 둔화시킬 뿐만 아니라 정상대조 군에 비해 기억력이 향상되었으며 이는 정상기억 강화의 잠재성을 제시하였다. 이러한 LJ529의 예방효과와 더불어 치료효과가 있는지 평가하기 위해여 streptozotocin의 쥐 대뇌 공동에의 투여를 통하여 산발성 알츠하이머 모델을 실험적으로 도입하였다. LJ529와 donepezil은 각 군에서 첫 번째 streptozotocin 투여 14일부터 33일째 되는 날까지 매일 경구 투여되었다. 기억력의 변화는 첫 streptozotocin 투여일로부터 22일 째, 23일 째 수동회피실험을 이용하여 측정되었다. 대조 군과 LJ529 처치 군에서의 지연시간은 유의한 차이를 보였으며 이는 LJ529가 streptozotocin에 의한 치매 병리를 회복시켰음을 내포한다. 마지막으로 새로이 도입된 산발성 치매 모델의 유효성은 세 가지의 서로 다른 조직에서 p-IRS와 GSK-3β의 발현량 비교를 통하여 부분적으로 확인되었다. 이 때 p-IRS의 발현량 변화는 total-IRS의 변화에 대응된다. 비록 A3AR 효능제인 LJ529의 신경보호적, 기억개선적 역할에 대한 메커니즘이 추후 명확하게 규명되어야 하지만 본 연구의 결과들은 LJ529가 알츠하이머의 새로운 예방적이며 치료적인 약물 후보가 될 수 있다는 가능성을 제시한다.