Evaluation of photo-ocular irritancy of phloxine B on SIRC cells and 3D reconstructed human cornea model

Abstract

Photo-irritation is an acute toxic response from chemicals applied to the body topically or systemically, which is either elicited or increased after subsequent exposure to light. Many researchers have investigated phototoxic potential of chemicals on skin cells or skin models. However, solar light affect most sun-exposed parts of our bodies, including eyes, but few studies have addressed the adverse effects of photo-irritants on eyes. Phloxine B is one of the tar-color additives permitted for use in both drugs and cosmetics in the United States, and also in foods. Phloxine B is widely used in color cosmetics such as lipsticks and eye shadows. Although it is known to induce severe eye irritation (UN GHS Cat 1), there is no limitation on using this dye around eye area in Korea. Furthermore, photo-irritancy of phloxine B on eyes has not been studied yet In this study, we investigated the photo-irritancy of Phloxine B under UVA irradiation using in vitro assays. Photo-cytotoxicity on Statens Seruminstitut Rabbit Corneal (SIRC) cells was evaluated with MTT assay. To see if oxidative stress is induced by phloxine B with UVA irradiation, CM-H2DCFDA fluorescence staining and GSH/GSSG colorimetric assay were conducted. In addition, mode of cell death was identified by flow cytometric and fluorescent image analysis. To complement some limitation of cell assays, 3D reconstructed human cornea model (MCTT HCETM) which exhibits in vivo-like morphological and growth characteristics was used to evaluate the photo-cytotoxic effect of phloxine B on human corneal tissue. Based on our results from these assays, toxicity of phloxine B was increased after subsequent UVA irradiation compared to non-irradiated groups in various aspects. Therefore, this study suggests the risk of using phloxine B in cosmetics, particularly eye make-up products under sun-light irradiation. ;광독성 (광자극성)은 화학물질이 전신 또는 국소적으로 적용된 후 빛에 노출되었을 때 증가하거나 유도되는 독성반응을 말하며, 특히 적은 용량에서 분명하게 나타나는 반응을 말한다. 많은 연구자들이 피부 세포나 피부 조직을 이용해서 화학물질의 광독성을 평가해왔으며 인공 조직모델을 이용하거나 화학적 방법을 사용하는 등 다양한 광독성 실험법도 개발되고 있다. 그러나 빛은 사람의 피부뿐만 아니라 눈을 포함한 몸 전체에 영향을 미친다. 하지만 눈에 대한 화학물질의 광독성을 평가하는 연구는 거의 진행되지 않아 이에 대한 연구가 필요하다. Phloxine B (적색 104호 (1))는 미국에서 의약품, 화장품 및 음식에 사용되는 타르색소 첨가제 중 하나이다. 미국 FDA 규정에 따르면 이 색소는 일반적인 화장품에 대부분 사용 가능하지만 눈 주위에서는 사용이 금지되어있다. 하지만 한국에는 눈 주위 사용에 대한 제한이 없으며, phloxine B의 광독성에 대한 연구는 일부 진행되어있으나 눈에 대한 광독성 연구는 진행되지 않았다. 따라서 본 연구는 여러 체외 시험법을 통해 phloxine B의 광독성을 UVA 조사군과 비조사군에서의 결과를 비교하여 평가하고 그 기전을 밝히고자 진행되었다. 토끼각막세포와 세포배양의 단점을 보완하는 인공조직모델을 사용하였으며 세포독성을 생존율과 현미경 관찰로 확인하고, 이에 대한 원인을 밝히고자 활성산소종 생성여부와 glutathione 양 감소도 확인하였다. 세포 사멸 패턴을 밝히기 위한 유세포분석 및 TUNEL 염색, 웨스턴 블롯팅도 진행하였다. 실험 결과 phloxine B 이 빛에 노출 되면 활성산소종이 증가하고 이에 따른 glutathione 양이 감소함으로써 농도에 따라 세포자멸사 또는 괴사에 의한 세포 사멸이 일어나는 것을 확인했다. 따라서 phloxine B의 눈 주위에 사용하는 것에 대한 규제가 필요하며 주의해야 한다.