Effects of Interferon-λ1 on Hepatitis C Virus-Infected Hepatocytes and Human Natural Killer Cells

Abstract

Hepatitis C virus (HCV) is an important human pathogen that can cause chronic hepatitis, liver cirrhosis, and hepatocellular carcinoma in the infected patients. HCV infection may induce the secretion of pro-inflammatory cytokines and interferons (IFNs) and the natural killer (NK) cell response, which belong to the innate immune response. In particular, IFN-λ1, which is a member of the type Ⅲ IFNs and an effective antiviral cytokine, increases in HCV infection. NK cells would be important in the innate immune response to HCV infection by interacting with HCV-infected liver cells. Though the antiviral activity of IFN-λ1 have been studied well, there are merely a few reports regarding the immune-regulatory effect of IFN-λ1. IFN-λ1 cannot directly modulate NK cell function due to absence of IFN-λ receptor chain 1 (IFN-λR1). However, IFN-λ1 is able to stimulate HCV-infected hepatocytes. This study investigated, therefore, whether IFN-λ1-stimulated hepatocytes modulate the function of interacting NK cells in HCV infection. To examine the effect of IFN-λ1 on the HCV replication, the cytokine secretion by HCVinfected cells, and the function of NK cells, cell-culture generated HCV virions, hepatoma cell lines, such as Huh7.5, Huh7, and HCV-core replicon Huh7 cells, and primary human NK cells were employed. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR), flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and western blot were performed to measure HCV genomic RNA and mRNAs expressed by HCV-infected cells, NK cell phenotype and function, secreted cytokines and chemokines, and HCV proteins and IFNstimulated gene (ISG) proteins expressed in the infected cells, respectively. IFN-λ1 effectively reduced the replication of HCV genomic RNA and HCV core protein, and increased the transcription and translation of ISGs, such as MX1 and IFIT1, in HCV virion-infected Huh7.5 cells which are acutely infected as well as HCV-core replicon Huh7 cells which bear the persistently replicating incomplete HCV genome. In addition, IFN-λ1 induced the mRNA expression of pro-inflammatory cytokines, such as TNF-α, chemokines, such as RANTES (CCL5), MIP-1β (CCL4), and IP-10 (CXCL10), and IFNs, such as IFN-α and IFN- λ1, in HCV-infected Huh7.5 cells. IFN-λ1 also induced the mRNA expression of pro-inflammatory cytokines, TNF-α and IL-6, chemokines, IL-8 (CXCL8) and IP-10, in HCV-core replicon Huh7 cells. Among the cytokines and chemokines of which the mRNA expression increased after IFN-λ1 treatment, the secretion of IP-10 protein by HCV-infected Huh7.5 cells and HCVcore replicon Huh7 cells significantly increased. Although IP-10 can induce the chemotaxis of NK cells, the concentration of IP-10 secreted by HCV-infected Huh7.5 cells in vitro was not enough to elicit the migration of NK cells. High doses of recombinant IP-10 induced, however, NK cell migration. Moreover, pre-treatment of NK cells with IP-10 enhanced the migration. Indeed, NK cells from HCV-infected patients with high plasma levels of IP-10 migrated more than NK cells from HCV-infected patients with low concentration of IP-10 in the plasma did. Because HCV-infected patients had similar levels of CXCR3, which is a chemokine receptor binding IP-10, the different migration rate would be independent of CXCR3. In conclusion, IFN-λ1 was able to indirectly regulate the chemotaxis of NK cells through induction of IP-10 secretion by HCV-infected cells. IFN-λ1 would be, therefore, a potential target for modulating NK cell migration in HCV infection.;대부분의 감염된 사람들에게 간염, 간경변, 간암을 유발하는 C형 간염 바이러스(hepatitis C virus; HCV)는 선천면역반응을 자극해 염증 사이토카인과 인터페론(IFN)의 분비 및 자연살해세포(NK cell) 반응을 유도한다. 이 중 인터페론-람다1(IFN-λ1)은 효과적인 항바이러스 사이토카인으로, HCV에 감염되었을 때 증가한다고 알려져 있으며 NK세포는 HCV에 감염된 간세포와 상호작용하여 HCV감염에 대한 면역반응에서 중요한 역할을 한다. IFN-λ1의 항바이러스 활성에 대해서는 연구가 활발히 이루어 졌지만 면역조절 영향에 대해서는 알려진 바가 많지 않다. NK세포는 IFN-λ1 수용체를 발현하고 있지 않기 때문에 IFN-λ1이 NK세포의 기능을 직접 조절할 수는 없지만 HCV에 감염된 간세포는 자극할 수 있다. 본 연구에서는 HCV에 감염되었을 때 IFN-λ1의 자극을 받은 간세포가 NK세포의 기능을 조절할 수 있는지를 확인하고자 하였다. HCV의 복제, HCV에 감염된 간세포에 의한 사이토카인 분비, NK세포의 기능에 대한 IFN-λ1의 영향을 조사하기 위해 세포배양을 통해 생성된 HCV 비리온과 간암세포주와 사람 NK세포를 사용하였다. 역전사-정량적 중합효소 연쇄반응, 효소면역분석법, 면역블로팅으로 HCV에 감염된 간세포에서 IFN-λ1에 의한 HCV 유전체, 인터페론자극유전자, 사이토카인 발현 및 분비를 측정하였고 유세포분석으로 NK세포 표현형 및 기능을 분석하였다. IFN-λ1은 MX1과 IFIT1같은 인터페론자극유전자의 전사와 번역을 증가시켰으며 HCV 유전체 RNA와 core 단백질을 효과적으로 감소시켰다. 또한 IFN-λ1은 HCV에 감염된 Huh7.5 세포와 HCV-core replicon Huh7 세포에서 염증사이토카인, 케모카인의 mRNA 발현을 유도했다. 특히 IFN-λ1처리 후에 두 세포에서 IP-10 단백질의 분비가 유의하게 증가되었다. IP-10은 NK세포의 주화성을 유도할 수 있지만 본 실험 조건에서 사용된 HCV에 감염된 Huh7.5 세포에서 분비된 IP-10농도는 NK세포를 이동시킬 만큼 충분하지 않았다. 하지만 높은 농도의 재조합 IP-10은 NK세포의 이동을 유도했으며 IP-10의 전처리는 NK세포 이동률을 더 증가시켰다. 실제로 혈장에 높은 IP-10 농도를 가지고 있는 HCV환자의 NK세포는 낮은 농도의 IP-10을 가지고 있는 환자의 NK세포보다 더 많이 이동했다. HCV에 감염된 환자들은 IP-10 수용체인 CXCR3를 모두 비슷한 수준으로 발현하고 있었기 때문에 IP-10의 전처리 정도에 의한 NK세포의 다른 이동률은 CXCR3에 비의존적일 수 있다. 결론적으로, IFN-λ1은 HCV에 감염된 세포에서 IP-10 분비를 유도함으로써 NK세포의 주화성을 간접적으로 조절할 수 있었다. 따라서 IFN-λ1은 HCV감염에서 NK세포의 이동을 조절하여 기존에 사용되고 있는 치료제를 보조할 수 있을 것으로 보인다.