Development of molecular diagnostic platform for the detection of point mutation using dumbbell-shaped molecular inversion probe (MIP)

Abstract

유전적 돌연변이는 여러 암 발생의 주요 원인으로 DNA 복제 시 자연적으로 발생하는 내부적 요인 또는 흡연, UV rays, 그리고 chemicals와 같은 외부적인 요인에 의해서 발생하게 된다. 특히 점 돌연변이의 경우 광범위한 질병에서 나타나며 흔하게 발견되는 biomarker가 존재하는데 EGFR 21 point mutation, P53, KRAS and BRCA가 그 예이다. 이는 대부분 심각한 유전적 변이 상태로 여겨지며 유전자 발현으로 이어지는 경우 특정 장기의 심각한 결함을 가져오게 된다. 또한 유전적 점 돌연변이는 약물에 대한 감수성을 떨어트려 질병 치료에 큰 장애요소가 된다. 질병의 진단 및 약물에 대한 개개인의 반응을 예측하기 위해서 점 돌연변이의 조기진단은 필수적인데 일반적인 진단방법으로 PCR과 DNA sequencing 방법이 이용되어 왔다. PCR 및 DNA sequencing은 높은 선택성 및 정확도를 갖는 장점이 있지만 연구실 및 병원과 같은 특정한 장소, 숙련된 연구원, 그리고 복잡한 기기가 필수적으로 요구된다는 한계점이 있다. PCR 및 DNA sequencing방법에서 벗어나 보다 간편한 진단방법으로 DNA base pairing 기반 진단기술이 연구되었다. 하지만 DNA base pairing 기반 진단기술에 경우 바이러스 질병의 진단 혹은 세균의 종 구분과 같이 명확하게 정해진 염기서열을 진단하는 경우 DNA hybridization의 높은 선택성을 보여주어 진단이 쉽게 이루어지지만 단 하나의 염기서열이 다른 ‘점 돌연변이’를 진단하는 경우에는 DNA base pairing 기반 진단기술에만 의존하는 방식은 여전히 문제점을 갖는다. 덤벨 모양 템플릿을 이용한 gap filling approach는 점 돌연변이 진단에 새로운 접근 방식으로써 기존 DNA base pairing 기반 진단기술의 문제점인 점 돌연변이 타겟에 대해 낮은 선택성을 보이는 것을 보완하여 매우 선택적이고 정확한 진단을 구현 할 수 있는 장점이 있다. 타겟 유전자에 점 돌연변이가 발생한 단 하나의 염기서열과 상보 결합하는 염기서열을 삭제한 DNA template을 디자인하고 삭제된 염기서열에 알맞은 dNTP로 합성하는 방법을 통하여 매우 선택적인 점 돌연변이 염기서열을 검사할 수 있다. 본 연구에서는 non-small cell lung cancer (NSCLC)에서 주로 발생하는 EGFR 21 point mutation을 model target으로 선정하여 점 돌연변이 진단 연구를 수행하였다.;Genetic mutation is one of the major cause of serious disease including cancer. The early diagnosis is important not only for the initial assessment of treatment outcome, but also the monitoring of individual variation in response to drugs. EGFR 21 point mutation is commonly founded in non-small cell lung cancer (NSCLC) patients. Molecular inversion probe (MIP) has been investigated as a novel detection method to identify the point mutation of EGFR21 as compared to standard analysis including conventional PCR and DNA sequencing. In this work, we have developed a gap filling detection approach with dumbbell shaped molecular inversion probe (dMIP) to achieve highly specific and selective analysis for EGFR 21 point mutation. MIP is designed to have a gap which is match to the mutated allele for reducing background induced by a single nucleotide mismatch. The dMIP is composed of two separated DNA strands and they are readily self-assembled to form a dumbbell shape structure with the appropriate length of stem and loop region. In the presence of EGFR 21 point mutation, dMIP hybridizes with target gene and subsequently gap filling and ligation reaction are achieved in a single step. This detection process is capable of highly selective recognition of single nucleotide mismatch from wild type gene. Finally, this approach promises a bright future in the diagnosis of various genetic mutations.