Understanding the Functions and Mechanisms of p63 Phosphorylation

Abstract

TAp63α is an isoform of p63 and a member of the p53 tumor suppressor family. While p53 acts as a guardian of the genome in somatic cells, its function is dispensable in germ cells. Instead, p63 is a critical mediator of the DNA damage response in female germ cells. Upon DNA damage, TAp63α is phosphorylated and oocytes undergo TAp63α -dependent cell death. Our recent results indicate that ATM is the major kinase involved in IR-induced TAp63α phosphorylation at S/TQ (Serine/Threonine-Aspartate) target sites. Based on this initial link between IR-induced TAp63α phosphorylation and IR-induced cell death, we sought to determine the molecular mechanisms by which TAp63α phosphorylation actually mediates oocytes death. We tested the possibility that S/TQ phosphorylations at the C-terminal domain of TAp63α may be important for inducing a conformational change that leads to TAp63α protein tetramerization, which is thought to be required for downstream target gene expression of death-inducing genes. I designed assays to test this model and generated and used various TAp63α conformational change and phosphorylation mutants to confirm validity of the results obtained. I also designed a TAp63α tandem affinity purification (TAP) construct which could be used to identify new, IR-induced TAp63α phosphorylation sites in an unbiased approach. By TAP, I identified novel non S/TQ sites in the C-terminal domain surrounding the S/TQ sites described earlier. Interestingly, all of these sites appear to cluster in a C-terminal region of the TAp63α that has been described as a second transcriptional activation domain (TA2). These results are summarized in a model for how IR-induced DNA double strand breaks triggers oocytes death by inducing TAp63α phosphorylation at specific sites.;TAp63α는 p63 isoform 중의 하나이자 암 억제 유전자인 p53 family의 일원이다. p53은 체세포에서 유전자를 수호하는 역할을 하지만 생식세포에서는 불필요하다. 대신, 난모 세포에서는 p63이 DNA 손상이 발생했을 때 세포 사멸을 유도하는 중요한 매개자가 된다. DNA 손상이 감지되면, TAp63α는 인산화되고 난모세포는 TAp63α에 의한 세포 사멸에 이르게 된다. 본 연구실의 최근 결과에 따르면, ATM이 방사선에 의한 TAp63α의 S/TQ (Serine/Threonine-Aspartate) 위치의 인산화를 중재하는 주된 kinase로 밝혀졌다. 방사선에 의한 인산화, 그리고 방사선에 의한 세포 사멸의 연결고리를 기반으로 하여 우리는 TAp63α의 인산화가 세포 사멸을 유도하는 분자적 메커니즘을 규명하려고 했다. 우리는 TAp63α의 C-terminal domain에 존재하는 S/TQ 인산화가, 세포 사멸 유도 유전자 등의 downstream target 유전자를 발현하는데 필요한 TAp63α의 중합체 형성에 중요한지 살펴보고자 했다. 결과들의 정당성을 입증하기 위하여 TAp63α의 다양한 구조적 변형과 인산화 돌연변이들을 만들어 분석하였다. 또한 방사선에 의해 인산화되는 TAp63α의 새로운 위치들을 선입견 없이 무작위로 찾아내기 위해 TAp63α tandem affinity purification (TAP) construct를 만들었다. TAP를 통해 S/TQ가 아닌 새로운 인산화 위치들을, 위에서 언급한 C-terminal domain 부근에서 발견할 수 있었다. 흥미롭게도, 많은 인산화 위치가 TAp63α의 C-terminal 쪽에 존재하는 2번째 transcription activation domain (TA2)에 무리 지어 있는 것으로 나타났다. 위의 결과들은 방사선에 의한 유도된 DNA double strand breaks들이 TAp63α의 특정 위치의 인산화를 통해 난모 세포의 사멸을 일으키는지에 대한 모델에 제시되어 있다.