Microbial Synthesis of ω-Hydroxycarboxylic, ω-Aminocarboxylic, and α,ω-Dicarboxylic Acids from Renewable Fatty Acids

Abstract

Medium chain ω-hydroxycarboxylic acids, ω-aminocarboxylic acids, and α,ω-dicarboxylic acids are widely used for the preparation of various chemical products such as polyamides and polyesters, fragrances, and antimicrobial agents. Thereby, the study has focused on the biosynthesis of the medium chain carboxylic acids from renewable long chain fatty acids by using recombinant Escherichia coli-based biocatalysts. First, ω-hydroxy carboxylic acids were produced from plant-originated fatty acids (e.g., ricinoleic acid) via multi-step enzymatic reactions by an alcohol dehydrogenase (ADH) from Micrococcus luteus NCTC2665, a Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMO) from Pseudomonas putida KT2440 or P. fluorescens DSM50106, and an esterase from P. fluorescens SIK WI. The biocatalytic cascade reactions allowed to produce ω-hydroxycarboxylic acids with various chain lengths of C9, C11, and C13 and n-carboxylic acids with chain lengths of C7 and C9 from ricinoleic acid, lesquerolic acid, oleic acid, and linoleic acid. ω-Hydroxycarboxylic acids, which were produced from oxidative cleavage of fatty acids via the multistep enzymatic reactions described above, were then oxidized to α,ω-dicarboxylic acids by the alcohol dehydrogenase (AlkJ) from P. putida GPo1 or converted into ω-aminocarboxylic acids by a serial combination of AlkJ from P. putida GPo1 and an ω-transaminase of Silicibacter pomeroyi. Interestingly, the double bonds present in the fatty acids such as ricinoleic acid and lesquerolic acid were reduced by E. coli-native enzymes during the biotransformations. These results indicated that the industrially relevant building blocks (C9 to C13 saturated α,ω-dicarboxylic acids and ω-aminocarboxylic acids) can be produced from renewable fatty acids using biocatalysis. With an aim to reach high biotransformation productivity, functional expression of the cascade enzymes in recombinant E. coli was investigated. In specific, 3’-untranslated region (3’-UTR) was engineered to increase soluble expression of the BVMOs, which had been mostly expressed in an insoluble form. 3’UTR engineering has been focused on decrease of stability of translationally active mRNAs to reduce translation rates and thereby to lower protein expression level in E. coli BL21 (DE3). Insertion of the gene fragments containing putative RNase E recognition sites into the 3’UTR of the BVMO genes led to reduction of the corresponding mRNA level in E. coli BL21(DE3). However, the amount of BVMOs in soluble fraction was remarkably enhanced resulting in a significant increase of in vivo catalytic activity. The increase of whole-cell biocatalytic activity notably correlated to the number of putative RNase E endonucleolytic cleavage sites in the 3’UTR. Thereby, it was assumed that 3’UTR engineering can be used to improve soluble expression of heterologous enzymes in E. coli as well as to fine-tune the enzyme activity in microbial cells. This study will contribute to development of a new environmentally friendly biocatalytic process for the production of carboxyl synthons, such as medium-chain ω-hydroxy carboxylic acids, α,ω-dicarboxylic acids and ω-aminocarboxylic acids. ;중쇄 오메가 하이드록시카르복실산, 알파, 오메가 디카르복실산, 오메가 아미노카르복실산과 같은 중쇄 카르복실산은 폴리아미드-6,10, -6,12 등의 엔지니어링 플라스틱이나 유화제, 동결방지제, 부식방지제 생산에 사용이 가능하며 또한, 식품이나 화장품에서 항균 소재로 이용되고 있다. 따라서, 본 연구에서는 재조합 Escherichia coli 기반 생촉매를 이용한 생물전환을 통해 장쇄 지방산으로부터 중쇄 카르복실산 생산에 관한 연구를 진행하였다. 연구 2에서는 중쇄 카르복실산 생산을 위해 alcohol dehydrogenase (ADH), Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMO), esterase로 이루어진 새로운 생합성 경로를 디자인하였으며, 선행연구 탐색을 통해 각 단계에 적용 가능한 효소로 Micrococcus luteus NCTC2665 유래 ADH, Pseudomonas putida KT2440 또는 P. fluorescens DSM50106 유래 BVMO, P. fluorescens SIK WI 유래 esterase를 선정하였다. 선정된 효소들은 Escherichia. coli에 도입하여 생촉매를 구축하였으며, 이를 이용하여 생물전환을 진행한 결과, ricinoleic acid, lesquerolic acid, oleic acid, linoleic acid와 같은 장쇄 지방산으로부터 다양한 탄소 수를 갖는 중쇄 카르복실산 생산이 가능하다는 것을 확인하였다. 연구 3에서는 연구 2에서 구축된 생합성 경로에 효소를 추가적으로 도입하여 확장함으로써 생산 가능한 카르복실산의 범위를 넓히고자 하였다. 기존의 생합성 경로를 통해 생산된 오메가 하이드록시카르복실산은 연쇄적인 alcohol dehydrogenase의 단독 반응 또는 alcohol dehydrogenase와 ω-transaminase의 복합 반응을 통해, 각각 알파, 오메가 디카르복실산 또는 오메가 아미노카르복실산으로 전환이 가능하다. 이 때 추가 도입한 효소는 선행연구 탐색을 통해 P. putida GPo1 유래 ADH인 AlkJ와 Silicibacter pomeroyi 유래 ω-transaminase로 선정하였다. 불포화 지방산인 ricinoleic acid 또는 lesquerolic acid으로부터 생산되어 이중결합을 포함하는 카르복실산의 경우, 환원된 형태로 생산되는데 이는 생물전환이 진행되는 동안 E. coli 유래 효소에 의한 것으로 판단된다. 이러한 결과는 구축된 생합성 경로의 확장을 통해 더욱 다양한 중쇄 카르복실산 생산이 가능하다는 것을 보여준다. 연구 4에서는 구축된 생합성 경로를 도입한 생촉매의 생산성을 높이기 위해, E. coli 내에서 3’UTR engineering을 통한 효소의 수용성 발현 향상에 대한 연구를 진행하였다. 앞서 구축된 생합성 경로에 포함되는 효소 중 BVMO는 E. coli 내에서 대부분 활성을 갖지 않은 불용성 형태로 생산되어, 이를 개선하기 위해 3’UTR engineering을 진행하였다. BVMO의 3’UTR에 다수의 잠재적 RNase E 절단 부위를 갖는 특정 서열을 도입시킨 결과, BVMO의 mRNA 발현 수준 감소에 의해 전체적인 단백질 발현 수준은 감소하지만, 수용성 발현은 향상되어 결과적으로 전세포 촉매의 효소활성이 증가하는 결과를 나타냈다. 이때 효소 활성의 증가 정도는 3’UTR 내 잠재적 RNase E 절단 부위의 개수와 높은 상관 관계를 보였다. 따라서, 3’UTR engineering은 E. coli 에서 외래 유전자 발현 시, 수용성 발현을 향상시키고, 미생물 내에서 효소활성을 최적으로 조절하는데 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 연구들은 장쇄 지방산으로부터 오메가 하이드록시카르복실산, 알파, 오메가 디카르복실산, 오메가 아미노카르복실산과 같은 중쇄카르복실산의 친환경적 생산공정을 개발하는데 기여할 것으로 생각되며, 향후 산업화를 위해 E. coli 내에서 효소들의 발현 최적화나, 중쇄 카르복실산에 대한 내성 균주 개발 등 고수율 생산에 대한 연구가 후속되어야 할 것으로 생각된다.