Biochemical Characterization of PD associated Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1

Abstract

Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1 (UCH-L1)은 ubiquitin을 떼어내는 효소이다. 이 단백질은 파킨슨 씨 병 환자의 뇌에서 발견되었으며 뇌 단백질의 약 1%을 차지하고 신경퇴행성 질병에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 연구진에서는 UCH-L1이 암 전이에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혀냈으며 최근에 UCH-L1의 이성질체가 폐암과 신경아세포종 세포에서 존재하는 것을 알게 되었다. UCH-L1과는 반대로 이 이성질체는 효소 활성을 가지고 있지 않으며 암의 침윤이나 전이에 관여하지 않는다. 반면에 본 연구진은 이 이성질체가 활성 산소종에 민감하게 반응, 분자간 이황화 결합에 의해 불용성 응집체를 만드는 것을 확인했다. 또한 질량분석기(MS spectrometry)와 Cysteine 돌연변이를 이용한 수소-중수소 교환을 통해 이 이성질체의 구조를 분석했다. 이를 통해 UCH-L1의 이성질체는 활성 산소종에 민감하게 반응해서 쉽게 응집되고, 이는 파킨슨씨 병에서 중심적인 역할을 하는 미토콘드리아에 위치한다는 것을 확인했다. 나아가서 UCH-L1 이성질체가 과발현된 세포종에서는 활성산소종을 제거하는 역할을 통해 Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)에 의한 세포독성을 저해함으로써 세포를 보호한다. 이것은 이 새로운 UCH-L1의 이성질체가 이황화 결합에 의한 응집과 미토콘드리아로의 국재화를 조절, 활성 산소종과 미토콘드리아의 손상에 의한 파킨슨씨 병에서 중심적인 역할을 할 것이라는 점을 시사한다. 우리는 이전 연구에서 UCH-L1의 효소 활성이 암 전이와 침윤에 관여한다는 것을 보였으며 이는 UCH-L1이 다양한 암의 치료 표적이 될 수 있다는 가능성을 나타냈다. 본 연구에서는 화합물 구조에 기반해서 새로운 UCH-L1 활성 저해제를 찾고자 하는 시도를 했으며 Corylifolia Fructus (보골지) 에서 유래한 천연물인 Bakuchiol이 효소 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 구조-활성 관계를 이용해서 화합물 구조를 최적화한 결과, Bakuchiol 유도체 중 1개가 효소 활성을 억제하고 암 세포의 침윤을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 앞으로 전이성 암을 포함한 UCH-L1 관련 질병치료를 위한 선도물질 탐색에 잠재적으로 도움이 될 것이다.;Ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH-L1), which is a deubiquitinating enzyme, comprises about 1% of brain protein. Also, it is believed to play an important role in neurodegenerative diseases such as Parkinson’s disease (PD) because UCH-L1 was found in Lewy body in PD patient (Lowe et al., 1990). Our previous study shows that UCH-L1 plays a key role in tumor metastasis. We recently identified the isoform of UCH-L1 in lung cancer and neuroblastoma cell lines. Contrary to UCH-L1, this isoform has no enzymatic activity and is not involved in tumor invasion and metastasis. However, we found that this isoform easily forms insoluble aggregates linked by intermolecular disulfide crosslinking in response to ROS. Structural analysis of this isoform was performed by hydrogen-deuterium exchange (HDX) experiment using mass spectrometry and cysteine mutation studies. This confirmed that UCH-L1 isoform is readily aggregated in response to ROS, and protein aggregation causes this isoform to localize in mitochondria, of which dysfunction is associated with PD. Overexpression of UCH-L1 isoform protects cells from CCCP-induced cell death by acting as a ROS scavenger. This result suggests that new UCH-L1 isoform plays a key role in PD induced by ROS and mitochondrial damage, by regulating disulfide-linked aggregate and mitochondrial localization. Our previous studies demonstrated that hydrolase activity of UCH-L1 is crucial for tumor invasion and metastasis. Thus it can be a therapeutic target for various metastatic cancers. This study was undertaken to discover novel small molecule inhibitors for the hydrolase activity of UCH-L1. We employed structure-based drug screening and found Bakuchiol, a natural product from Corylifolia Fructus. After further optimization of the structure, one of the bakuchiol derivatives showed an inhibitory activity in vitro and decreased cancer cell invasion significantly. It is potentially helpful to the identification of a lead compound for UCH-L1 related diseases including metastatic cancers.