Effects of Kaempferol on Reactive Oxygen Species (ROS)-mediated Platelet Activation

Abstract

혈소판은 혈액 세포들 중 하나로, 복잡하고 다양한 기전을 통해 혈액 응고에 중요한 역할을 담당한다. 혈소판은 혈관 내에서 활성화되지 않은 상태로 순환하다가, 혈관 내벽이 손상을 받게 되면, 이를 인지하여 활성화됨으로써 혈전 형성을 통한 지혈작용과 같은 고유한 기능을 수행한다. 활성화된 혈소판은 활성산소종 (Reactive Oxygen Species, ROS)의 생성을 증가시키고, 생성된 ROS는 혈소판의 활성화를 더욱 촉진시킨다. Kaempferol (KF)은 flavonoid 계통의 물질로서 항산화, 항혈소판 그리고 항죽상동맥경화증과 같은 다양한 생리활성을 나타낸다. 하지만 활성화된 혈소판으로부터 생성이 증가된 ROS를 통한 신호전달을 KF이 어떻게 조절하여 항혈소판작용을 나타내는지에 대해서는 아직 명백히 알려진 바가 없기 때문에, 본 연구에서는 이를 밝혀보고자 하였다. 본 연구에서는 KF이 항혈소판 및 항산화 효과를 나타낸다고 알려진 바와 같이, agonist인 collagen에 의해 혈소판이 활성화되었을 때 나타나는 특징인 aggregation과 ROS의 증가가 KF에 의해 억제되었다. 다음으로 KF이 collagen에 의해 활성화된 혈소판으로부터 생성된 ROS에 어떻게 영향을 미치며, 이의 downstream 신호전달을 조절하는 기전에 관하여 연구하였다. Protein tyrosine phosphatase (PTP)는 redox에 민감한 signaling molecule로서 효소 활성부위에 ROS에 의해 산화되는 cysteine 잔기를 가지고 있다. Src homology region (SH)2 domain-containing tyrosine phosphatase-2 (SHP-2)는 PTP의 subfamily로서 혈소판의 활성화를 억제시키는 중요한 인자들 중 하나인데, 항산화 효과를 가지는 KF이 collagen에 의해 생성이 증가된 ROS에 의한 SHP-2의 cysteine 잔기의 산화를 억제하였다. 또한, KF이 SHP-2의 cysteine 잔기의 산화를 억제하였기 때문에, 이로 인해 enzyme activity가 저해되는 것을 막음으로써, 혈소판 활성화에 관여하는 spleen tyrosine kinase (Syk), Phospholipase Cγ2 (PLCγ2), Bruton’s tyrosine kinase (Btk), Vav1 단백질 등의 특정한 tyrosine 잔기의 인산화를 억제시키는 효과가 있다. Collagen 자극으로 혈소판의 활성화 신호전달이 시작되면, 활성화된 PLCγ2는 downstream signaling을 통해 혈소판 내의 Ca2+ level을 증가시키 고, 증가된 Ca2+은 inside-out signaling을 통해 fibrinogen의 receptor인 integrin αIIbβ3를 활성화시킨다. 하지만 KF이 PLCγ2의 tyrosine 잔기의 인산화를 감소시키기 때문에 그 활성이 감소되어, 이러한 downstream signal인 혈소판 내의 Ca2+ level 증가와 integrin αIIbβ3 활성화 역시 감소되었다. 연구 결과들을 통해 KF의 항산화, 항혈소판 효과를 확인하였기 때문에, 실제로 건강식품으로 인식되는 차에 많이 포함된 KF을 섭취하였을 때, 혈소판 활성화에 의한 혈전 형성을 억제하는 효과가 나타나는지 확인해 보았다. 그 결과, KF는 마우스의 경동맥혈관 손상에 의한 혈전의 형성을 지연시키는 효과를 나타내었다. 이상의 연구 결과들을 종합해 볼 때, 혈소판이 활성화 될 때 증가되는 ROS가 SHP-2의 활성부위의 cysteine을 산화시켜 그 활성이 저하되는데, KF이 항산화작용을 통해 phosphatase 활성을 유지시키는 기전을 통하여 항혈소판 효과를나타 낸다고 생각된다.;It has been shown that kaempferol (KF), a flavonoid commonly found in plants, possesses biological effects including antioxidative and antiplatelet properties. I also observed that KF inhibited markedly aggregation of human platelets induced by collagen. When activated, platelets induce the generation of reactive oxygen species (ROS), which can potentiate signaling cascades that promote shape change, granule release, and aggregation. Although the antiplatelet effects of KF are likely to be due to its function as ROS scavenger, it has not been clarified yet which ROS-mediated signaling pathways are down-regulated by KF in platelets. To elucidate the mechanism by which KF inhibits platelet stimulation, I studied its effects on ROS elevation and protein tyrosine phosphorylation in collagen-stimulated platelets. Interestingly, protein tyrosine phosphorylation was inhibited by KF with concomitant suppression of increase in cellular ROS. It has been well documented that Protein tyrosine phosphatase (PTP) contains a catalytic cysteine residue sensitive to ROS-mediated oxidation and inactivation, and that SH2 domain-containing PTP-2 (SHP-2) is apparently recruited to the collagen receptor-containing signaling complex and appears to play a negative regulatory role in collagen-mediated platelet activation. In this study, collagen-induced ROS led to oxidative inactivation of SHP-2, which is inhibited by KF. The phosphorylation of specific tyrosine residues on signaling molecules including spleen tyrosine kinase, phospholipase Cγ2 (PLCγ2), Bruton’s tyrosine kinase and Vav1 was diminished by KF, potentially via protection of SHP-2 from ROS-mediated inactivation. As subsequent results from diminished activation of PLCγ2, collagen-induced elevation of cytoplasmic calcium and integrin αIIbβ3 activation are also inhibited by KF. Moreover, in vivo studies of KF administered orally demonstrated antithrombotic effects in ferric chloride carotid artery injury models in mice. Collectively, these data suggest that KF’s antiplatelet and antithrombotic efficacy are largely due to inhibitory effects on SHP-2 oxidation and subsequent down-regulation of tyrosine phosphorylation-dependent signaling pathways.