Monoclonal Antibody Characteristics and Protective Efficacy against Respiratory Syncytial Virus G Protein

Abstract

Respiratory syncytial virus (RSV) is a common cause of lower respiratory tract illness in infants, young children, and the elderly. Currently, there are no effective vaccines to prevent this illness. Prophylaxis with the monoclonal antibody (mAb) Palivizumab against F fusion RSV protein was shown to be effective in preventing viral infection. RSV encodes three surface proteins (F, G, and SH). Among them, the G glycoprotein plays a role in host cell attachment and also modulates the host immune response via a CX3C motif that mimics fractalkine, thereby inducing disease pathogenesis. We generated two monoclonal antibodies (5H6 and 3A5) using G protein core fragment (Gcf) injections, which consisted of amino acid residues 131 to 230 from RSV A2 G protein and formed disulfide bonds between four cysteines (Cys-173, 176, 182, 186). An epitope mapping study revealed that 5H6 specifically binds to the G/164-176 peptide that includes conserved sequences shared by both RSV A and B subtypes, and 3A5 binds to the G/190-204 peptide. 5H6 binds with a 30-fold higher affinity to epitope than does 3A5. To investigate the binding characteristics of these mAbs, we generated mutant Gcf proteins in which cysteine residues were substituted with alanine. Although 5H6 binds the G/164-176 peptide that contains Cys-173 and 176, it requires four cysteines for binding Gcf. 3A5 forms stronger bonds with mutant Gcf than wild-type Gcf, suggesting that the epitope is better recognized by 3A5 when the correct cysteine loop is absent. To determine if these mAbs have neutralization activity, BALB/c mice were administered mAb and subsequently challenged with RSV. On day 4 post-infection, lung viral titers were reduced by up to 93% with the 5H6 injection and 90% with the 3A5 injection, indicating that prophylactic injection of these mAbs contributes to RSV clearance in vivo. Our study also demonstrated that G protein-associated chemotactic activity was reduced by 5H6 (p<0.001) and 3A5 (p<0.05). Overall, our results show that novel anti-G mAbs have protective efficacy in vivo and reduce G protein-associated chemotactic activity. Therefore, these antibodies could be used as a prophylactic regimen against RSV infection.;호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory syncytial virus)는 영유아와 노인층의 상하부 호흡기 질환을 일으키는 중요한 병원체이다. 현재 RSV에 대한 백신은 개발되지 않았고 RSV의 F 융합 단백질에 대한 단클론항체인 Palivizumab (Synagis)이 바이러스의 감염을 막는데 효과적인 것으로 알려져 있어서 예방용 항체로 쓰인다. RSV는 막 외부에 F, G, SH 단백질을 발현하고 있고, 그중에 G 당단백질의 서열 변이에 따라 RSV는 A와 B 두가지 아형으로 나뉜다. G 당단백질은 숙주세포에 부착하는데 관여하고 fractalkine의 CX3C 구조를 가지고 있어서 숙주의 면역반응을 교란시키는 역할을 하여 질병을 악화시킨다고 알려져 있다. 우리는 RSV 두 가지 아형 사이 G 당단백질의 아미노산 서열이 비교적 잘 보존되어 있는 131-230 부분을 Gcf (G core fragment)라고 이름붙였고 이러한 Gcf를 생쥐에 주입하여 두 가지의 단클론항체 (5H6, 3A5)를 얻게 되었다. 각각의 단클론항체에 관한 항원결정기 (epitope)를 확인해 본 결과, 5H6는 G 단백질의 164-176 부분에 결합하고, 3A5는 190-204 부분에 결합하는 것을 확인하였다. 항체의 친화력 (affinity)을 조사해본 결과, 5H6가 3A5보다 항원결정기에 대한 친화력이 약 30배 정도 높은 것으로 나타났다. G 당단백질의 경우 보존서열에 4개의 cysteine 아미노산이 존재하고 이들 사이는 이황화 결합으로 연결되어 고리구조를 형성하는데 이러한 구조와 보존된 cysteine 아미노산들은 RSV에 대한 면역반응을 유도하는데 중요하다고 알려져있다. 우리는 Gcf에 대한 단클론항체의 결합이 이러한 보존된 cysteine과 고리구조와 서로 상관관계가 있는지 알아보기 위해 cysteine을 alanine으로 치환한 Gcf를 만들어서 결합력을 확인해 보았다. 그 결과, 5H6는 4개의 cysteine이 모두 존재해야 Gcf에 가장 잘 결합하였고 3A5는 cysteine 유무에 따라 Gcf에 대한 결합력에 차이가 있는 것으로 보아 cysteine 잔기의 유무가 Gcf 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 보여진다. 그리고 Gcf에 대한 단클론항체가 RSV에 대한 중화능력이 있는지 확인해보기 위해 항체를 BALB/c 생쥐에 근육내 주사를 하고 다음날 RSV를 감염시켰다. 감염 4일 뒤 폐에서 바이러스 역가를 측정해 본 결과 5H6는 93%, 3A5는 90% 정도 역가가 감소하는 것으로 나타났다. 하지만 in vitro에서는 RSV에 대한 중화능력이 없는 것으로 나타났다. 또한 단클론항체의 결합이 CX3C 부분을 가려주어 Gcf에 의해 나타나는 화학주성활성 (chemotactic activity)을 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 실험결과들을 통해 Gcf에 대한 단클론항체인 5H6와 3A5가 in vivo에서 RSV에 대한 중화능력이 있는 것과 화학주성활성을 감소시켜주는 것을 확인하였고 이를 통해 RSV 감염에 대한 치료용 항체로 사용할 수 있는 가능성을 확인하였다.