Paricalcitol attenuates TGFβ1-induced Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) via Modulation of NLRP3 Inflammasome in Human Peritoneal Mesothelial Cells (HPMCs)

Abstract

Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is known as a key mechanism of peritoneal fibrosis in patients on peritoneal dialysis. The inflammasome is a multiprotein oligomer that promotes the maturation of proinflammatory cytokine, IL-1β and IL-18. The best characterized one is the NLRP3 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors, pyrin domain-containing protein 3) inflammasome, which is comprised of the NLRP3, the adapter ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain) and pro-caspase-1. Paricalcitol, a selective agonist of vitamin D, is reported to exert potent anti-fibrotic effect in organ fibrosis, however there are no studies about the role of paricalcitol and inflammasome on peritoneal fibrosis. We investigated whether activation of the NLRP3 inflammasome was involved in TGFβ1-induced EMT and paricalcitol imposed any effect on peritoneal EMT. EMT was evaluated by morphologic changes and expression of E-cadherin as a epithelial cell marker and α-smooth muscle actin (α-SMA) as a mesenchymal cell marker after stimulation of TGFβ1 (1 ng/mL) with or without paricalcitol (50 nM) in human peritoneal mesothelial cells (HPMCs). Mechanisms responsible for peritoneal EMT including generation of reactive oxygen species (ROS), activation of NADPH oxidase (NOX) and NLRP3 inflammasome were investigated. To clarify the role of NLRP3 inflammasome in EMT, the effect of NLRP3 gene silencing by a treatment of siNLRP3 or caspase inhibitor (Z-VAD-FMK, 10 μM) on TGFβ1-induced EMT was examined in HPMCs. TGFβ1-induced EMT of HPMCs was associated with an up-regulation of NLRP3, ASC and procaspase-1 and an increased production of IL-1β and IL-18. TGFβ1-induced EMT was ameliorated by either siNLRP3 or caspase inhibitor. TGFβ1 enhanced generation of ROS with an increase in NOX activity and mitochondrial NOX-4 mRNA expression. Anti-oxidants (N-acetylcystein and mitotempo) ameliorated TGFβ1-induced activation of NLRP3 inflammasome. Paricalcitol alleviated TGFβ1-induced EMT and expression of each components of NLRP3 inflammasome, which was associated with a decrease in NOX activity and mitochondrial NOX4 mRNA expression in HPMCs. In conclusion, paricalcitol ameliorated TGFβ1-induced EMT of HPMCs via modulation of NOX-dependent activation of NLRP3 inflammasome. Paricalcitol treatment could be a novel approach to protect the peritoneum from the development of EMT and peritoneal fibrosis in PD patients.;상피-중간엽 세포이행 (Epithelial-to-Mesenchymal Transition, EMT)은 복막투석 환자에서 복막 섬유화의 핵심 기전으로 알려져 있다. 복막투석 환자는 전신 염증반응이 활성화 되어있을 뿐 아니라 복강 내에도 염증성 미세환경이 조성되어 있으며 이는 복막기능의 변화와도 연관되어 있다. 인플라마좀은 선천성면역에 관여하는 다중 단백질 중합체로 염증성 사이토카인인 IL-1β 및 IL-18의 생성을 촉진한다. NLRP3 인플라마좀은 인플라마좀 중 가장 활발히 연구되어지고 있으며 NLRP3 (NLR family pyrin domain containing 3), ASC (Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain), pro-caspase-1으로 구성되어있다. 비타민 D의 선택적 작용제인 paricalcitol은 장기 섬유화에서 항섬유화 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 복막 섬유화에 paricalcitol의 역할에 대한 연구는 아직 발표된 바 없다. 본 연구에서는 가장 잘 알려진 인플라마좀의 하나인 NLRP3 인플라마좀의 활성화가 TGFβ1 유도 EMT 기전에 관여하는지 확인하고, paricalcitol이 복막 중피 세포의 EMT에 어떤 영향을 미치는지 알고자 하였다. EMT는 TGFβ1 (1 ng/㎖)와 paricalcitol (50 nM)을 처리하여 상피세포 지표인 E-cadherin과 중간엽세포 지표인 α-SMA의 발현으로 평가 하였다. 또한 TGFβ1에 의한 활성산소 발생, NOX (NADPH oxidase)의 활성화, NLRP3 인플라마좀의 활성화 등을 확인하였다. NLRP3 인플라마좀이 EMT에 미치는 영향은 siNLRP3, siASC, caspase 억제제인 Z-VAD-FMK 처리후 TGFβ1에 의한 EMT의 변화로 조사하였다. 복막중피세포에서 TGFβ1는 EMT를 유도하였고 이는 NLRP3, ASC, caspase-1의 증가와 IL-1β와 IL-18의 생성 증가와 동반되었다. TGFβ1에 의한 EMT는 siNLRP3, siASC 및 Z-VAD-FMK에 의해 완화되었다. TGFβ1는 ROS생성, NOX의 활성, 미토콘드리아 NOX-4 mNRA발현을 증가시켰다. 항산화제 (N-acetyl-cystein 및 mitotempo)는 TGFβ1에 의한 NLRP3 인플라마좀의 활성을 완화시켰다. Paricalcitol은 TGFβ1에의한 EMT, NLRP3 인플라마좀 활성화를 억제시켰으며 이는 NOX 활성 감소, 미토콘드리아 NOX4 mRNA 발현 감소와 동반되었다. 세포기질에 존재하는 p47phox는 활성산소 발생시 세포막으로 이동하여 세포막 단백질인 p22phox와 결합하였다. 면역침강반응을 이용하여 TGFβ에 의해 p22phox와 p47phox의 결합 증가를 확인하였으며, paricalcitol이 이를 억제하는 것 또한 확인하였다. 결론으로, paricalcitol은 NOX의 활성도 감소 및 NOX4 발현 억제를 통한 항산화효과로 NLRP3인플라마좀 활성을 조절하였고 EMT 억제효과를 나타내었다. Paricalcitol은 복막 투석 환자에서 EMT 진행 및 복막 섬유화로부터 복막을 보호하기 위한 새로운 치료법이 될 수 있을 것으로 기대된다.