Role of INO80 chromatin remodeler in tumorigenesis and its regulation by BAP1 tumor suppressor

Abstract

진핵 세포의 DNA는 뉴클레오좀으로 압축되어 있음으로써 세포 내 단백질들이 표적 DNA에 접근하는 것에 대한 장애물로 작용한다. 크로마틴 리모델링은 이 러한 장애물을 극복하게 하는 대표적인 기작으로, DNA 전사, 복제, 복구 등의 핵 내 과정에 필수적이다. INO80는 ATP-의존적 크로마틴 리모델링 복합체인 SWI/SNF 집단의 일원이며, 정상 상태의 DNA 복제와 정지된 DNA 복제 fork의 회복에 기능함으로써 유전체 안정성 유지에 기여하는 것으로 보이기 때문에 암 억제인자라고 예상된다. 이를 뒷받침하는 근거로서, BAP1이란 암 억제인자 가 INO80를 조절하는 데 있어서 중요한 것으로 밝혀졌다. BAP1은 탈유비퀴틴 화를 통해 INO80를 안정화시켜서 복제 fork로 불러들임으로써 효과적인 DNA 복제와 유전체 안정성 유지를 가능케 한다. 하지만 어떤 분자적 기작이 DNA 복제에 대한 INO80의 기능을 조절하는지, 그리고 종양형성에 있어서 INO80가 어떤 기능을 할지에 대해서는 더 많은 연구가 필요한 상태이다. 필자는 본 논 문에서 이 사안들을 다루고 있다. 102 첫번째로, INO80가 BAP1 결손 암세포에서 BAP1에 의한 안정화 기작 의 부재로 인해 하향 조절된 것을 증명함으로써, BAP1의 암 억제 기능을 설명 하는 분자적 근거를 제시했다. 그 다음에는, 자외선에 의한 DNA 손상 또는 하 이드록시유레아(HU)에 의한 DNA 복제 스트레스가 왔을 때 BAP1과의 결합이 유도되는 단백질로서 단일 가닥 DNA 절단 (SSB) 복구에 중요한 요소로 알려 진 PARP1을 찾아냈다. BAP1-PARP1 결합 유도는 스트레스 투여량 의존적이며 일시적이다. BAP1은 PARP1의 안정성에 영향을 주지 않는 반면에, PARP1의 과발현은 BAP1을 증가시켰다. 중요한 점은, PARP1이 DNA 손상과 복제 스트 레스에 반응해서 BAP1을 파(PAR)화 시킨다는 것이다. 따라서 이러한 결과들 은 BAP1이 PARP1의 새로운 표적임을 증명하며, DNA 손상 복구와 정지된 복 제 fork 회복에 있어서 BAP1-INO80 경로를 PARP1과 연결 짓고 있다. 두번째로는, 유전자 적중 쥐 모델을 이용하여 INO80의 생체 내에서의 기능을 연구하였다. 일반적으로 유전체 불안정성은 쥐 모델에서 종양형성을 촉진한다고 알려져 있지만, 최근 연구들에 의하면 다른 유전적 배경 변화에 따라 유전체 불안정성이 반대로 암을 억제할 수도 있다고 밝혀졌다. INO80 크 로마틴 리모델링 복합체는 정상 상태의 DNA 복제 시 복제 fork의 진행을 촉 진하고 스트레스에 의해 정지된 fork를 회복시킴으로써 유전체 안정성을 유지 하는 데에 필수적인 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 필자는 Ino80가 제거된 쥐는 배아 발생 도중 죽음에 이르며, 이형접합체의 경우 살아서 태어난 뒤 정 상적인 표현형을 나타내는 것을 보았다. 이어서 Ino80가 대장암 발생에 어떤 영향을 미치는지 보기 위해 Ino80 +/- 쥐를 Apc Min/+ 쥐와 교배시켰다. Ino80 +/- 103 Apc Min/+ 쥐는 Ino80 +/+Apc Min/+ 쥐에 비해 선종성 용종이 적게 형성되는 것으로 나타났다. Ino80 발현량 감소는 CHK1 활성화를 통해 세포자살을 촉진한다는 것을 Ino80 +/-Apc Min/+ 쥐의 용종 조직 및 사람의 대장암 세포 내에서 증명하였 다. 이러한 결과들을 통해, Ino80 반수체부족성(haploinsufficiency)이 과도한 DNA 복제 스트레스를 일으켜서 CHK1을 활성화시킴으로써 세포자살 촉진을 통해 대장암의 발생을 억제한다고 결론 내릴 수 있다.;The DNA of eukaryotic cells is packaged into nucleosomes and higher-order chromatin structures, which restricts the access of cellular proteins to their target DNA. Chromatin remodeling is a prominent mechanism that overcomes such barrier and is necessary for various nuclear processes including transcription, replication, and DNA repair. INO80, a member of the SWI/SNF-family ATP-dependent chromatin remodeling complexes, has been shown to play a critical role in maintaining genome stability through its activities for normal DNA replication and stalled replication fork recovery, suggesting that INO80 may function as a tumor suppressor. In support of this possibility, the BRCA1-associated protein-1 (BAP1) tumor suppressor has turned out to be an important regulator of INO80; it stabilizes via deubiquitination and recruits INO80 to replication forks, thereby ensuring efficient DNA synthesis and genome stability. However, the molecular mechanisms that regulate the INO80 function in DNA replication and the role of INO80 in tumorigenesis have remained largely unexplored. In this thesis, I sought to address these important issues. In the first part of my thesis, I demonstrated that INO80 is downregulated in BAP1-defective cancer cells due to the lack of an INO80 stabilization mechanism via BAP1, providing a molecular basis for the tumor-suppressing function of BAP1. Next, I identified poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1), a key player in repair of single stranded DNA breaks, as a factor that inducibly binds to BAP1 in response to UV-induced DNA damage and hydroxyurea (HU)-induced replication stress. The induction of BAP1-PARP1 interaction is dose dependent and transient. While BAP1 has no effect on PARP1 stability, PARP1 overexpression increases BAP1. Importantly, PARP1 PARylates BAP1 in response to DNA damage and replication stress. These results therefore identify BAP1 as a new target of PARP1 and link PARP1 to the BAP1-INO80 pathway for DNA damage repair and stalled replication fork recovery. In the second part of my thesis, I studied the in vivo functions of INO80 using gene-targeted mouse model. While genomic instability promotes tumorigenesis in mice, recent studies suggest that it also can act as a tumor suppressor by inhibiting tumorigenesis depending on the context of other genetic changes. INO80 chromatin remodeling complex has been shown to be critical to maintain genome stability, which is attributed to the activities to promote efficient fork progression during normal DNA synthesis and recover stress-induced stalled replication forks. Here, I show that Ino80 deletion in mice results in embryonic lethality and that heterozygotes are born alive and generally normal in phenotypes. To determine the effects of Ino80 on colon cancer tumorigenesis, I crossed Ino80+/- with ApcMin/+ mice. Ino80+/-ApcMin/+ showed decreased adenomatous polyps compared to Ino80+/+ApcMin/+ mice. A reduction of Ino80 level leads to CHK1 activation and increased apoptosis in the adenomatous polyps of Ino80+/-ApcMin/+ mice as well as in human colon cancer cells. These results suggest that Ino80 haploinsufficiency inhibits colon cancer tumorigenesis via increased apoptosis, which is due to the activation of CHK1 by excessive replication stress.