Engineering of a Baeyer-Villiger monooxygenase-based Escherichia coli biocatalyst for biotransformation of fatty acids

Abstract

Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO) from Pseudomonas putida KT2440 catalyzes the conversion of linear ketones into esters by introducing an oxygen atom near the carbonyl group. Thereby, the target product ester acid can be produced via the fatty acid biotransformation by Escherichia coli expressing the BVMO gene. Since the BVMO is not so stable under reaction conditions, the enzyme was engineered to improve its stability and activity. A number of fusion or soluble tags have been studied as the methods to increase functional expression of the BVMO in E. coli. Herein, various fusion tags including ubiquitin (Ub), hexa-lysine (K6), hexa-glutamate tag (E6) were introduced to N-terminal of BVMO. Among those enzymes, fusion of the hexa-glutamate (E6) tag into N-terminal of the BVMO appeared to lead to a significant enhancement of functional expression in the recombinant E. coli under room temperatures, resulting in a large increase of its bioconversion activity of ricinoleic acid. In addition, introduction of a synthetic promoter (i.e., J23100) into the BVMO gene expression system allowed the enzyme to be constitutively expressed without any inducer in the recombinant E. coli. Finally, the recombinant E. coli expressing the engineered BVMO constitutively was applied to biotransformation of ricinoleic acid and oleic acid. The recombinant E. coli BL21(DE3)::pAPTm-E6BVMOopt-ADH expressing the alcohol dehydrogenase of Micrococcus luteusNCTC2665 and the engineered BVMO produced the ester acid to a final concentration of 21 mM from 30 mM ricinoleic acid within 4 h. These results indicate that the target product ester acid can be efficiently produced by biotransformation of the recombinant E. coli expressing the engineered BVMO without inducer.;Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO) from Pseudomonas putida KT2440 는 인접한 carbonyl group에 산소를 도입하여 ketone을 ester로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다. 따라서 E. coli가 생성하는 BVMO에 의해 지방산의 생물전환에서 target product인 ester acid를 만들 수 있다. BVMO가 반응 조건에서 안정하지 않기 때문에, 안정성과 활성을 개선하기 위해 BVMO가 engineering되었다. 그 동안 E. coli에서 BVMO를 기능적 발현을 증가시키기 위한 방법으로 다양한 fusion tags 혹은 soluble tags가 연구되었다. 여기서는 그 중 ubiquitin (Ub), hexa-lysine (K6), hexa-glutamate tag (E6) 등의 여러 가지 fusion tag을 BVMO의 N-terminal에 도입되었다. 이러한 효소들 중에서 E6 tag이 붙은 fusion BVMO의 경우 실온에서 재조합 E. coli에서 BVMO의 상당한 기능적 발현을 이끌어 내었다. 따라서 ricinoleic acid의 생물전환 활성을 크게 증가시켰다. 게다가 BVMO의 발현 시스템에 J23100과 같은 합성 프로모터의 도입은 재조합 E. coli내에서 inducer 없이도 효소를 항시적으로 발현할 수 있도록 한다. 마지막으로 engineered BVMO를 항시 발현하는 재조합 E. coli는 ricinoleic acid와 oleic acid의 생물전환에 적용되었다. Micrococcus luteusNCTC2665유래의 alcohol dehydrogenase와 engineered BVMO를 발현하는 재조합 E. coli BL21(DE3)::pAPTm-E6BVMOopt-ADH는30 mM의 ricinoleic acid로 생물전환 하여 4시간 만에 최종농도 21 mM의 ester acid를 생성했다. 이 결과는 target product인 ester acid가 inducer없이 engineered BVMO를 발현하는 재조합 E. coli의 생물전환에서 효율적으로 생산할 수 있음을 나타낸다.