Effects of 60Hz Magnetic Fields on DNA Damage Responses in HT22 Mouse Hippocampal Cell Lines & Inhibition of HSP27 attenuates radiation induced fibrosis

Abstract

(Part I) 극저주파 전자기장 (Extremely low-frequency magnetic fields, ELF-MFs)은 300Hz보다 낮은 파장대를 나타내며, X-ray와 gamma ray에 비해 상대적으로 파장이 길고 에너지가 작은 비전리 방사선에 속한다. 1979년 Wetheimer와 Leeper의 논문에서 고압전력선에서 발생되는 60Hz 극저주파 전자기장이 소아 백혈병의 원인이 되고 있다고 발표한 이래로 극저주파 전자기장의 유해성에 대한 논의가 계속 되어지고 있으나, 소아 백혈병 외의 암과 같은 질병에 연관성은 명백히 밝혀진 바가 없다. Comet assay는 세포수준에서 DNA의 손상을 측정하는 방법으로 유전독성을 평가하는데 사용되어진다. 먼저, comet assay를 통해 DNA의 손상을 확인했다. IR은 DNA를 손상시키는 물질로써 ROS를 일으켜 세포의 apoptosis를 일으키는 역할을 한다. 본 실험에서는 이온화방사선을 positive control로 설정하였다. 2mT 극저주파 전자기장과 10Gy의 이온화방사선을 HT22 cell (mouse hippocampal cell lines)에 노출시켰을 때, olive comet tail moment를 측정한 결과 대조군과 큰 차이를 갖지 않는 것을 확인하였다. 그러므로 comet assay보다 100배 더 민감하다고 알려져 있는 γ-H2AX를 western blot으로 확인하는 실험을 진행하였다. γ-H2AX는 DNA의 손상 정도를 감지할 수 있는 마커로써 암이나 노화, 임상연구에서도 많이 사용되어진다. 따라서 본 연구에서는 HT22세포에 2mT 극저주파 전자기장에 노출시켰을 때 세포손상 정도를 western blot으로 γ-H2AX를 측정하고, 세포주기를 특정할 수 있는 FACS를 진행하였다. 먼저 western blotting을 통하여 세포 유전자손상 정도를 확인해 본 결과, 2mT 극저주파 전자기장을 6시간과 12시간동안 노출한 결과, 대조군과 비교하여 큰 차이를 나타내지 않았다. FACS 실험을 통해 세포주기를 측정한 결과에서도 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 2mT 극저주파 전자기장을 6시간과 12시간 동안 주고 세포 수를 측정한 실험에서, 6시간동안 노출한 군에서 미미하지만 세포증식이 증가한 것을 확인 하였다. 하지만 12시간동안 2mT 극저주파 전자기장에 노출한 군에서는 세포증식의 증가가 나타나지 않았다. 본 연구에서는 2 mT 극저주파 전자기장을 노출 하였을 때 다양한유전자손상을 나타내는 comet tail, gamma H2AX, 다핵형성등에 큰 변화가 없는 것으로 결론을 얻었다. 하지만 6시간동안 2mT를 노출한 HT22 cell에서 세포증식이 유의하게 증가하는 결과를 보여 2mT 극저주파 전자기장이 뇌세포의 유전자손상이나 세포주기에는 큰 영향을 미치지는 않지만 세포의 증식에 영향을 줄 수 있을 가능성이 있음을 제시한다. (Part II) 폐암은 남성과 여성에서 가장 많이 걸리는 암 중의 하나이며, 사망률이 가장 높은 암이다. 현재 섬유화는 폐의 방사선치료에서 가장 큰 부작용이다. 현재 섬유화를 타겟으로 한 약이 적으며, 부작용이 많다. 또한 이러한 폐섬유화 환자에서 HSP27이 과발현 되어 있음이 보고되고 있으며 HSP27은 섬유화 치료 타겟으로 주목 받고 있다. 현재 가장 첨단의 방사선 치료법인 stereotactic body radiotherapy (SBRT)와 비슷한 조건으로 실험하기 위해 high-dose per fraction irradiation (HDFR)을 쥐의 폐에 focal로 조사하여 HSP27의 발현을 조사했다. 쥐는 90Gy HDFR의 방사선 조사 후 1주, 2주, 3주, 4주에 부검되었다. 이전 연구에서 Trichrome staining과 Sirius red staining을 통하여 Collagen deposition은 증가를 확인하였고, 또한 cDNA microarray analysis를 통한 분석에서 EMT에 관련된 유전자가 증가되어 있음을 확인하였다. 이러한 증가된 HSP27의 발현의 증가를 감소시킴으로써 섬유화를 억제할 수 있을 것으로 예상하였고 이를 증명하기 위해 본 연구에서는 HSP27의 비이상적 cross linker인 J2 화합물을 스크리닝하였고 HSP25 단백질에 J2를 50 uM 의 농도로 처리하였을 때 HSP27 비이상적 이형체를 형성시키는 것을 확인하였으며, 섬유화에 관련된 marker들의 발현을 억제 시키는 것을 확인하였다. 이를 통해 HSP27의 비이상적 cross linker가 방사선에 의한 폐섬유화를 억제시킬 수 있는 가능성을 확인하였다.;(Part I) Previously, we investigated extremely low-frequency magnetic fields (ELF-MFs) on diverse DNA damage responses, such as phosphorylated H2AX (γH2AX), comet tail moments, and aneuploidy production in several non-tumorigenic epithelial or fibroblast cell lines. However, the effect of ELF-MF on DNA damage responses in neuronal cells may not be well evaluated. Here, we investigated the effects of ELF-MF on the DNA damage responses in HT22 non-tumorigenic mouse neuronal cells. Exposure to a 60-Hz, 2 mT ELF-MF did not produce any increased γH2AX expression, comet tail moments, or aneuploidy formation. However, 2 mT ELF-MF transiently increased the cell number. From the results, ELF-MF could affect the DNA damage responses differently, depending on the cell lines. (Part II) Currently, fibrosis is one of the biggest side effects of radiation therapy in lung and there are some reports that HSP27 overexpression involves in lung fibrosis. In this study, we analyzed HSP27 expression in mouse lungs after focal exposure of limited lung volumes to high-dose per fraction irradiation (HDFR), which is similar to stereotactic body radiotherapy (SBRT) in human radiation therapy. Mice were harvested after 1, 2, 3, and 4 weeks after 90Gy HDFR. A HSP27 altered cross linker, J2, which resulted in inhibition of HSP27 oligomerization, inhibited TGF-beta-mediated EMT related protein expression (fibronectin and E-cadherin) and IR-mediated EMT related protein(vimentin and twist) in L132 normal lung epithelial cells. From the results, we suggested that HSP27 is involved in radiation-induced fibrosis and inhibition of HSP27 may be a good target for the treatment of radiation-induced fibrosis.