Correlation between Prohibitin 1 Gene Expression and Susceptibility to Liver Disease through Human Liver Tissue Analysis

Abstract

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the cancers with the highest incidences and no noticeable symptom, which makes it lead to high death-rate. Therefore, developing the early diagnostic method is needed to minimize the liver damage and to lower the death-rate. Prohibitin 1 (PHB1) is mostly located in mitochondria inner membrane in eukaryotic cell. It functions as a chaperone to stabilize proteins produced by mitochondria. A previous study used the liver-specific Phb1 knockout mouse found that PHB1 had a strong influence on liver. In this regard, we hypothesized that the expression of PHB1 and other related genes was connected to liver diseases. The aims of this study are to investigate whether PHB1 expression affects to susceptibility of liver diseases and whether PHB1 and related genes show any differences depending on diseases, gender, and age. First, we analyzed PHB1 mRNA expression level in commercially-available 48 samples provided by TissueScan™ cDNA plate. The PHB1 expression level declined in the lesion group compared to that in the normal group. However in a HCC tumor group, it significantly increased compared to that of the normal. HCC tumor group was classified a according to American Joint Committee on Cancer (AJCC) staging system, PHB1 expression increased in G1 group, which was right after differentiated into cancer, but as histo-differentiation intensified, it tended to decreased again. Subsequently, we analyzed mRNA expression level of PHB1 in human normal and tumor liver samples of 50 patients. The mRNA expression level of PHB1 was higher in the tumor sample than normal sample. The result was coherent to the result from TissueScan™ cDNA plate sample. Since PHB1 expression was increased in liver cancer, we intended to compare PHB1 expression to the expression of α-fetoprotein (AFP) which was used as common HCC marker and glypican 3 (GPC3) which was usually used for potential marker of liver cancer. AFP and GPC3 mRNA expression was analyzed in both samples of TissueScan™ cDNA plate and human liver tissues. As a result, both AFP and GPC3 expression levels were increased greatly in tumor tissues in contrast of normal tissues. These results tended to have higher tumor grade as there were more expressions of AFP and GPC3. In samples from TissueScan™ cDNA plate, mRNA expression of both AFP and GPC3 also largely increased in HCC and especially GPC3 expression was increased relative to deepening of cancer differentiation. PHB1 expression was seemed to be decreased at disease level before cancer but it was noticed that its expression was drastically increased once it was transformed into liver cancer. However, unlike the increased expression level of AFP and GPC3 with the deepening of histo-differentiation, PHB1 expression levels tended to decrease gradually. These results suggest that the different tendency of GPC3, AFP, and PHB1 expression in different tumor samples can be used for diagnostic tools for the liver cancer and diagnostician knows about certain stage of cancer. Furthermore, these results had a potential possibility to be established as a marker of the HCC. In conclusion, PHB1 is closely related with liver disease and decreased expression level of PHB1 would raise the susceptibility of liver diseases.;Hepatocellular cancer (HCC)는 발병률이 높은 암 중 하나로, 뚜렷한 자각증상이 없는데, 이로 인하여 높은 사망률로 이어진다고 볼 수 있다. 따라서 간암을 조기 진단하는 방법을 개발하는 것은 간암으로 인한 손상을 최소화하고 사망률을 낮추는데 가장 효과적이고 필요한 일 중 하나이다. Prohibitin 1 (PHB1)은 진핵세포 내, 주로 mitochondria inner membrane에 위치하여 mitochondria에서 생성되는 단백질을 안정화시키는 chaperone의 기능을 함으로써, 세포의 항상성을 유지하는데 필수적인 역할을 하는 단백질이다. 간특이적으로 Phb1을 knock-out한 생쥐는 야생형 생쥐에 비해 탄생 직후부터 간손상이 발생되고 심화되었으며 최소 8개월령에는 자연적으로 간암이 발생하였다는 이전의 연구가 있으며, 이를 통해 Phb1 유전자의 제거는 간 기능에 많은 영향을 준다는 것을 보여주었다. 이에 본 연구에서는 사람에게서 나타나는 PHB1 및 관련 유전자의 발현량과 간 질환 발병의 관계를 파악해보고자 하였다. 우선 상업적으로 이용한 가능한 TissueScan™ cDNA plate의 48개의 sample에서 PHB1의 mRNA의 상대적 발현량을 보았을 때, cirrhosis와 fatty liver, hepatitis와 같은 lesion군의 PHB1 발현량이 normal에 비해 감소하는 모습을 보였으나, HCC tumor군에서는 normal에 비해 유의하게 증가된 모습을 보였다. 이러한 HCC tumor군을 AJCC 병기 분류에 따라 구분해보았을 때, cancer로 분화된 직후인 G1군에선 PHB1의 발현량이 normal에 비해 증가하였으나, G2, G3군으로 점점 조직의 분화가 심화됨에 따라 PHB1의 발현량은 다시 감소하는 경향을 보였다. 이어 실제 병원에서 50명의 환자의 정상 간 조직과 간암 조직을 공여 받아 분석해보았다. 이 연구에서 PHB1의 발현량은 normol보다 tumor에서 증가하는 모습을 보였고, 이는 TissueScan™ cDNA plate에서의 결과와 일관성 있는 경향을 보여주었다. 이러한 유전자 발현량의 차이가 염기서열의 변화에 의해서 생기는 것인지를 알아보기 위해 PHB1 유전자를 full sequencing을 하여 결과를 분석해본 결과, cDNA sequence상에서는 유의미한 차이가 없었다. 이어 TissueScan™ cDNA plate에서 이전의 아직 발표되지 않은 연구 결과를 통해 PHB1의 발현량과 연관관계가 있을 것이라고 예상한 H19과 insulin-like growth factor 2 (IGF2), CTCF의 발현량을 분석해보았다. 그 결과 PHB1의 발현량이 증가하였던 cancer differentiation G1군에서 H19과 IGF2의 발현량이 유의적으로 감소하는 모습을 보였고, 이는 이전의 아직 발표되지 않은 실험 결과와 유사한 경향을 나타내었다. PHB1의 발현이 간암에서 증가하는 모습을 보였기 때문에, 가장 보편적인 HCC marker로 사용되는 α-fetoprotein (AFP)과 간암의 potential marker로 사용되는 glypican 3 (GPC3)의 발현량을 TissueScan™ cDNA plate와 실제 사람의 간 조직 모두에서 분석하여 이들의 발현량과 PHB1의 발현량을 비교해보고자 하였다. 그 결과, AFP와 GPC3 두 유전자 모두 normal 조직과 비교해보았을 때 tumor 조직에서 매우 크게 그 발현량이 증가하였으며, tumor grade가 높아질수록 그에 따라 더 증가하는 경향을 보였다. TissueScan™ cDNA plate에서 또한 HCC에서 AFP와 GPC3의 mRNA 발현량이 크게 증가하였고, 특히 GPC3는 간암의 분화가 심화되는 것에 비례해서 증가하는 모습을 보였다. PHB1은 간암의 발생 전 질환 단계에서는 발현량이 감소하는 모습을 보이지만 막상 간암으로 분화되면 그 발현량이 급격하게 증가하였음을 알 수 있다. 그러나 분화가 심화됨에 따라 발현량이 증가하는 모습을 보이는 AFP와 GPC3와는 달리 차츰 감소하는 경향을 보인다. 이러한 결과들을 분석해 보면 현재 HCC의 marker로 인정받고 있는 AFP와 더불어 간암의 분화 정도에 따라 다른 경향을 보이는 GPC3와 PHB1 등을 combination하여 간암을 진단하는데 이용한다면 cancer의 stage까지도 진단할 수 있는 방법을 개발할 수 있는 가능성을 기대할 수 있을 것이다. 정리하면, PHB1는 간 질환과 밀접한 관련성이 있다는 것을 위 실험으로서 알 수 있었으며, 그에 따라 PHB1 발현량의 감소는 간질환에 대한 감수성을 높이는 것으로 생각된다.