유도만능줄기세포에서 NADPH oxidase 4에 의한 세포 분화 조절과 신경능선줄기세포 발달에 대한 연구

Abstract

최근 많은 연구에 의하면 활성산소(reactive oxygen species, ROS)는 세포내의 다양한 생리현상(cell proliferation, differentiation, death)에서 중요한 이차 신호전달물질로 알려져 있다. 특히 NADPH oxidase(Nox)는 외부에서 오는 다양한 자극과 그의 수용체에 의하여 그 활성이 조절되며, 그 활성화는 세포내의 활성산소 생성을 유도한다. 최근 Nox4에 의한 활성산소의 생성이 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSC)에서 신경세포(neuronal cells)로의 분화에 관여함을 보고하였다. 그러나 세포 수준에서 Nox4가 결핍이 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSC)에서 신경능선줄기세포로의 분화에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. Nox4가 결핍된 쥐의 태아섬유아세포(mouse embryonic fibroblast cells,MEF)로부터 유도만능줄기세포를 만들고 Nox4 KO 유도만능줄기세포로부터 삼배엽(three germ layer)으로 분화시켰을 때 외배엽(ectoderm), 내배엽(endoderm) 형성에는 차이가 없어 보였으나, 중배엽(mesoderm)으로의 분화가 이루어지지 않는 것을 확인하였다. 또한 Nox4 KO 유도만능줄기세포에서 신경능선줄기세포로 분화시켰을 때는 신경능선줄기세포로의 생성에 결함을 확인하였다. 그 결함은 배양체로부터 세포의 이동이 더디게 이루어져서 뻗어나가지 못하는 현상을 관찰하였다. 이 같은 줄기세포 이동의 결함이 Nox4로부터 생성되는 활성산소의 결함인지를 확인하기 위하여 그 배양체에 직접 활성산소를 넣은 결과 줄기세포의 이동이 회복되는 것을 확인하였다. 위의 결과를 종합적으로 판단하면 Nox4에 의해 생성되는 활성산소가 중배엽(mesoderm)으로의 분화에 영향을 미치며 특히 신경능선줄기세포(neural crest stem cells)이동에 관여함으로써 신경능선줄기세포의 분화에 영향을 끼친다고 판단된다.;Recently, many reports indicated that reactive oxygen species, (ROS) serve as second signaling messengers in various cellular events including cell proliferation, differentiation, and death. Especially, NADPH oxidase (Nox) generate cellular ROS in response to agonists. Previously, Professor bae’s lab reported that Nox4 is involved in neuronal cells from neural crest stem cells (NCSC). To validate the function of Nox4 in stem cell differentiation, I established induced pluripotent stem cells (iPSC) from Nox4 KO mouse embryonic fibroblasts (MEF). To examine the pluripotency of iPSC from wild type or Nox4 KO, we analyzed representative markers for endoderm, mesoderm, and ectoderm after differentiation. The iPSCs were induced to form EBs and then examined by immunohistochemistry with antibodies to βIII tubulin (for ectoderm), smooth muscle actin (for mesoderm) and α-fetoprotein (for endoderm). Nox4 KO iPSC failed to differentiation toward mesoderm and neural crest stem cells, compared to wild type. Interestingly, failure of differentiation toward neural crest stem cells was resulted from stem cell migration from embryoid body (EB). We hypothesized that Nox4 deficient iPSC cannot generate cellular ROS leading to failure of differentiation toward neural crest stem cells. To test this hypothesis, we added hydrogen peroxide into EB differentiation. Addition of hydrogen peroxide into EB resulted in increased cell migration and differentiation toward neural crest stem cells. Taken together, I concluded the Nox4-mediated ROS generation plays an important role in stem cell differentiation.