Optogenetic Stimulation Promotes Axon Outgrowth of Motor Neuron in vitro

Abstract

운동성 뉴런의 축삭 돌기는 전기적인 신호를 척수로부터 근육, 샘, 그리고 다른 장기들에 전달하는 중요한 역할을 한다. 목표 장기에 전달된 신호는 근육을 움직이거나 호흡을 하는 등의 역할을 하게 된다. 운동성 뉴런의 축삭 돌기가 손상을 입게 되면 전기적인 신호가 근육 또는 장기에 도달하지 못하게 되어 운동성 기능 장애를 유발한다. 운동 뉴런 질환 (Motor neuron disorder, MND) 또는 척수 손상 (Spinal cord injury, SCI)에 의해 축삭 돌기의 손상이 유발된다. 이 때 손상 된 축삭 돌기의 재생성은 운동성 기능 회복에 중요한 역할을 한다. 현재 손상된 축삭 돌기의 재생성을 촉진 시키기 위한 방법으로 neurotrophic factor 첨가 또는 전기자극 등의 방법이 연구되어 오고 있다. Nerve growth factor (NGF) 또는 Brain-drived neurotrophic factor (BDNF) 등을 사용하여 축삭 돌기 생성에 미치는 영향을 알아보는 실험이 연구되어 왔으며, 전기자극이 축삭 돌기의 생성에 미치는 영향을 알아보는 연구가 진행되고 있다. 본 논문에서는 축삭 돌기의 재생산을 위한 방법으로 광유전자 기법을 적용하였다. 광유전자 기법이란, 특장 파장대의 빛에 의해 세포막 전위를 조절할 수 있는 방법으로 광유전자를 운동성 뉴런에 적용하고 광유전자가 축삭 돌기의 생산에 미치는 효과를 알아보았다. 광유전자 종류의 하나로써 CatCh (Calcium translocating channelrhodopsin) 유전자를 사용하였으며 이는 자체 제작 한 473 nm 파장의 LED 자극 시스템에 반응하였다. CatCh 유전자가 발현된 운동성 뉴런에 LED 자극을 주고 그 다음날 세포를 고정시켜 면역 세포 화학적 분석방법을 사용하여 축삭 돌기의 길이를 분석하였다. 동일한 기간으로 세포 배양을 시행 했을 때, LED 자극을 한 세포의 축삭 돌기의 길이는 LED 자극을 하지 않은 세포에 비하여 약 2.4배 더 길게 자란 것을 확인 하였다. 또, 축삭 돌기의 성장에 관련된 단백질 Adenosine-3’, 5’-cyclic monophos-phate (cAMP) 분석을 하여 LED 자극이 가해진 세포에서 cAMP의 농도가 높아졌음을 확인함으로써 면역화학적 분석법에 의한 결과를 뒷받침할 수 있는 결과를 얻었다. 본 연구에서는 광유전자가 운동성 신경세포의 축삭 돌기의 성장에 도움을 주는 것을 보았다. 이 연구를 통해 광유전자 기법이 축삭 돌기의 재생성에 효과적인 방법으로써 사용될 수 있을 것으로 기대한다.;Axons of motor neurons play crucial role in conveying electrical signals from the spinal cord to muscles, gland and other effector organs. Motor neuron disease (MND) or spinal cord injury (SCI) has common symptom which is degeneration of motor neurons’ axons. Degeneration of axons may induce the disorder of motor function because of the failure of the movement commands from spinal cord. Therefore, axon regeneration is critical in recovering lost functions in this situation. To promote the axon regeneration, numerous strategies have been investigated including the application of neurotrophic factors or electrical stimulation. Here we suggest a new method to promote axon outgrowth. Since optogenetic can regulate membrane potential through specific wavelength light was applied to motor neurons (MNs), we examined the effectiveness of Channelrhodopsin (ChR) on the axon generation. MNs were transfected with CatCh, a calcium translocating ChR. The transfected MNs were stimulated by a custom-built array of 473nm light-emitting diode (LED) which is close to the excitation peak wavelength of CatCh. On the following day, the MNs were fixed and analyzed. The length of axon growth was quantified using beta-III tubulin immunocytochemistry. The axon length of transfected MNs was about 2.4 times longer than that of control MNs. We also quantitatively examined the effect of ChR stimulation on the expression of intracellular second messenger Adenosine-3’, 5’-cyclic monophosphate (cAMP) which is well known for promoting neurite outgrowth. The concentration of cAMP was higher in the CatCh-transfected and optically stimulated MNs than the one of control condition without optogenetic stimulation. These results suggest that the optogenetic modulation of motor neurons can be effective in axon sprouting acceleration.