Improved Production of Polyketide Immunosuppressants by Engineering of Regulatory Network and Precursor Supply

Abstract

본 연구는 면역억제물질인 라파마이신 (rapamycin)과 FK506을 생산하는 각각의 균주 스트렙토마이세스 라파마이시니쿠스 (Streptomyces rapamycinicus ATCC29253) 와 스트렙토마이세스 균주 KCTC11604BP (Streptomyces sp. KCTC11604BP) 에서 생합성 조절유전자의 기능을 규명하고 이를 통하여 면역억제물질의 생산성을 향상시키는 것을 목표로 하였다. 또한 FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 클라불리저러스 (Streptomyces clavuligerus CKD1119) 에 생합성 전구체를 공급하여 FK506의 생산성을 향상시키고자 하였다. 라파마이신의 조절유전자의 기능을 규명하기 위하여 본 논문의 3 장에서는 일차적으로 염기서열분석과 문헌비교를 통하여 5가지 조절유전자인 rapH, rapG, rapY, rapR, 그리고 rapS 를 예측하였다. 이 중 2가지 유전자, rapH 와 rapG 는 positive 조절유전자로서 라파마이신의 생합성에 관여함이 밝혀져 있었다. 따라서, rapY, rapR, 그리고 rapS 의 과발현 및 삭제를 통하여, 그 기능을 분석하였다. 그 결과, rapY, rapR, 그리고 rapS 를 과발현한 균주에서는 라파마이신의 생산성이 현저하게 감소한 반면, 스트렙토마이세스 라파마이시니쿠스의 전체 유전체에서 rapY 와 rapS 를 삭제한 균주에서는 약 4.6 배 (33.9 mg/l) 그리고 3.4 배 (25.2 mg/l) 라파마이신의 생산성이 향상되었다. 또한 야생생산균주와 rapY 그리고 rapS 를 삭제한 균주에서 생합성 유전자집단의 발현을 비교하기 위해 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 생합성 유전자집단의 발현이 야생생산균주보다 rapY 와 rapS 를 삭제한 균주에서 향상되었으며, 이러한 결과를 통해 대부분의 생합성 유전자집단의 유전자들이 negative 조절유전자인 rapY 와 rapS (Two-component 시스템에서 조절자인 RapR) 에 의하여 조절되고 있음을 확인하였다. 나아가, rapY 유전자의 발현은 rapX 유전자의 발현을 억제하고 있음을 확인하였다. 이러한 결과에 따라서, rapS 가 삭제된 균주에 rapX 를 추가적으로 발현시켜 야생생산균주보다 약 6.7 배 (약 49 mg/l) 라파마이신의 생산성이 향상된 균주를 제작할 수 있었다. FK506을 생산하는 여러 스트렙토마이세스 균주의 전체 유전체의 염기서열 분석을 통하여 FK506과 FK520의 생산균주에서 모두 존재하고 있는 fkbN 유전자와 스트렙토마이세스 균주 KCTC11604BP에만 존재하는 tcs2 와 tcs7 조절유전자를 예측하였다. 본 논문의 4 장에서는 예측된 tcs2, tcs7, 그리고 fkbN 유전자의 발현 및 삭제를 통하여 FK506의 생산성을 향상시키고자 하였다. 그 결과, 야생생산균주와 비교하여 tcs2 의 과발현 및 삭제균주에서는 FK506의 생산성에 변화가 없음을 확인하였다. 또한 fkbN 을 과발현시킨 균주에서는 약 2.0 배 (11.1 mg/l) FK506의 생산성이 향상되었고 전체 유전체에서 fkbN 을 삭제시킨 균주에서는 FK506이 생산되지 않았다. 반면 tcs7 을 과발현시킨 균주에서는 FK506의 생산성이 감소하였고 전체 유전체에서 tcs7 을 삭제시킨 균주에서는 약 1.9 배 (9.98 mg/l) FK506의 생산성이 향상되었다. 이에 따라서 tcs7 과 fkbN 유전자가 생합성 유전자 집단에 미치는 영향을 알아보고자 RT-PCR을 이용하여 생합성 유전자집단의 유전자들의 발현을 비교하였다. 그 결과, fkbN은 positive 조절유전자로 tcs7 은 negative 조절유전자로 기능을 규명할 수 있었다. 조절유전자의 기능 규명을 바탕으로 보다 향상된 FK506을 생산하는 균주를 제작하기 위하여 negative 조절유전자인 tcs7 이 삭제된 균주에 fkbN 을 과발현시킨 균주를 제작한 결과, 야생생산균주보다 약 4.0 배 (21 mg/l) FK506의 생산성이 향상된 균주를 제작할 수 있었다. 끝으로 본문의 5 장에서는, FK506의 전구체인 메틸말로닐 코에이 (methylmalonyl-CoA)의 공급에 효과적인 생합성 경로의 규명을 통하여 스트렙토마이세스 클라불리저러스에서 FK506의 생산성을 향상시키고자 하였다. 일차적으로 FK506의 생합성 전구체의 세포 내 양을 증가시키기 위하여 메틸올레이트를 배지에 첨가하였다. 그 결과, FK506의 생산성이 약 1.5 배 (8.89 mg/l) 향상되었고 세포 내 메틸말로닐 코에이의 양이 약 3 배 증가되었음을 확인하였다. 이를 통하여 세포 내의 메틸말로닐 코에이 양의 증가에 따라서 FK506의 생산성이 향상될 수 있음을 예측하였다. 더 나아가 이를 증명하고 FK506의 생산성을 향상시키기 위하여 외래 유전자로 메틸말로닐 코에이 뮤테이즈 (methylmalonyl-CoA mutase) 를 발현시키고 메틸올레이트 (methyloleate) 를 배지에 추가적으로 첨가하였다. 그 결과, 약 17.8 mg/l의 FK506을 생산하는 균주를 제작 할 수 있었다. 이는 FK506의 생합성과정중에 메틸말로닐 코에이가 제한요소이며 메틸말로닐 코에이 뮤테이즈가 가장 효과적으로 메틸말로닐 코에이를 공급하는 생합성 경로임을 보여주는 결과이다. 이상의 연구 결과는 면역억제물질인 라파마이신과 FK506의 조절유전자의 기능을 규명하고, 나아가 조절유전자의 삭제 및 과발현을 통하여 각 물질의 생산성을 최대로 향상시킬 수 있는 방법을 제안한 보고이다. 또한, FK506의 생합성 전구체의 공급에 가장 효과적인 생합성 경로를 규명하여 FK506의 생산성을 향상시킬 수 있음을 보인 보고이다. 이는 향후 다양한 이차대사산물의 조절유전자의 기능 규명 및 생산성 향상 연구에 기여할 것으로 예측된다.;The main focus of the present study is to characterize the function of putative regulatory genes involved in the biosynthesis of immunosuppressants including rapamycin and FK506 and enhance the biosynthetic precursor pools for the FK506 biosynthesis, in order to construct high producing strains. Rapamycin and FK506 have been used for clinically treating organ transplant rejection and autoimmune disease. However, the production level of rapamycin and FK506 often remains relatively low. Thus, improvement of the production titers of these low-yield compounds has been of great interest to industry. In this study, I characterized the regulatory genes crucial for understanding the mechanism of regulation and for constructing overproducing strains (Chapter 3, 4) and generated improved FK506 production strain through the use of heterologous expression of precursor pathways (Chapter 5). Chapter I describes a brief overview of immunosuppressants including rapamycin and FK506. The Materials and Methods section of chapter II provides technical information on improved production of rapamycin and FK506. In chapter III, the negative regulatory mechanism for rapamycin biosynthesis was revealed by characterizing the functions of rapY, rapR, and rapS genes in the rapamycin production strain S. rapamycinicus ATCC29253. The functions of these genes were examined through overexpression, in-frame deletion, complementation of deletion mutants, and transcriptional analysis of rapamycin biosynthetic gene clusters. Overexpression of each of the three genes resulted in decreased biosynthesis of rapamcyin, whereas in-frame deletion of rapY and rapS from S. rapamycinicus chromosome increased rapamycin production by about 4.6-fold (33.9 mg/l) and 3.4-fold (25.2 mg/l) compared to that of the wild-type strain, respectively. Gene expression analysis by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in the wild-type and mutant strains indicated that most of the rapamycin biosynthetic genes were regulated negatively by rapS (probably through its partner response regulator RapR) and rapY. The gene product of rapY negatively regulated the expression of rapX encoding an ABC-transporter. Finally, overexpression of rapX in the rapS deletion mutant resulted in a 6.7-fold (49 mg/l) increase in rapamycin production compared to that of the wild-type strain. These results demonstrated the role of RapS/R and RapY as negative regulators of the rapamycin biosynthesis. There are no known examples of FK506 producing strains in which regulatory genes have been manipulated to increase FK506 production. Based on a sequence analysis of the FK506 biosynthetic gene cluster, the FK506 cluster contained three putative regulatory genes, tcs2, tcs7, and fkbN. In chapter IV, the regulatory mechanisms of the Streptomyces sp. KCTC11604BP strain were established by characterizing the functions of tcs2, tcs7, and fkbN genes. The putative regulatory genes, tcs2, tcs7, and fkbN were expressed and in-frame deleted in Streptomyces sp. KCTC11604BP to characterize their functions in the FK506 production. Overexpression and in-frame deletion of tcs2 did not affect FK506 production compared to that of the wild-type strain. fkbN overexpression improved the levels of FK506 produced by approximately 2.0-fold (11.1 mg/l), and deletion of fkbN caused complete loss of FK506 production. Overexpression of tcs7 resulted in decreased FK506 production, whereas deletion of tcs7 increased FK506 production by 1.9-fold (9.89 mg/l) compared to that of the wild-type. Gene expression analysis by RT-PCR using wild-type and mutant strains demonstrated that most of the FK506 biosynthetic genes are regulated by fkbN in a positive manner and negatively by tcs7. Finally, fkbN overexpression in the tcs7 deletion strain resulted in a 4.0-fold (21 mg/l) increase in FK506 production compared to that in the wild-type strain. This study is the first report to decipher the regulatory factors involved in FK506 biosynthesis. In chapter V, the metabolic pathway involved in supplying methylmalonyl-CoA supporting FK506 biosynthesis in S. clavuligerus CKD1119 was identified. The methylmalonyl-CoA mutase pathway with methyloleate supplementation was effective for increasing FK506 titers in S. clavuligerus CKD1119. The resulting strain produced approximately 17.8 mg/l FK506, which was a 3.0-fold improvement compared to that of the wild-type. A comparative analysis of the intracellular acyl-CoA pools between wild-type supplemented with and without methyloleate revealed that the increased production of FK506 was due to an increased intracellular methylmalonyl-CoA level. These results show that the methylmalonyl-CoA supply is a limiting factor for FK506 biosynthesis and that the MCM pathway is a major methylmalonyl-CoA supply pathway in FK506 producers. In summary, the present study provides an efficient approach to improve production of the immunosuppressants, rapamycin and FK506.