Assessment of anti-cancer activity of a novel calpain inhibitor through regulation of p27 level in gastric cancer cells and assay development for detecting ischemia modified albumin

Abstract

Gastric cancer has been one of the largest causes of death for decades throughout the world, but yet remains without a standard therapy. Incidences may vary according to the status of each individual, but the necessity for early treatment is applied in all cases. Her2 is a transmembrane receptor of the epithelial growth factor receptor (EGFR) family, which is recognized to participate in several mechanisms concerning cell survival by activating a series of signaling pathways. It is encoded by ERBB2, a proto-oncogene, and is shown to participate in pathogenesis of certain types of cancers. Overexpression of Her2 oncoprotein leads to excess hetero- and homodimerization and activation, providing pro-survival signals. Needless overactivation of Her2 may thus increase the aggressiveness of cancer, resulting in poorer prognosis, drug resistance, and early recurrence. Therefore, regulation of Her2 activation is considered significant in increasing the efficiency of chemotherapy. Currently, trastuzumab is the most frequently used Her2-targeting drug approved by the FDA. It is an antibody against the extracellular domain of Her2, and has been proved efficient in Her2-overexpressing breast cancer cells. However, resistance is gained within a year and severe side effects are also reported. Thus, efforts are being put into in order to lessen the disadvantages and enlarge the efficacy of the medication. Calpain, a cytosolic cysteine protease, is also known to regulate many pathways involved in cell proliferation. Among its many roles in physiological and pathological conditions, participation of the enzyme in cancer regulation is most studied these days. Calpains have numerous substrates including p27kip1, a known inhibitor of cyclin-dependent kinases (Cdks). Once it inhibits the formation of cyclin-Cdk complexes, which is essential for transition from G1 to S phase, cell cycle arrest occurs. Based on the reports that showed p27kip1 levels are associated with calpains as well as trastuzumab, in this study, we focused on the different trends of calpain inhibition between Her2-positive and Her2-negative gastric cancer cell lines. Although further study is necessary, with the results implied in this thesis, a better insight into the relationship of calpain and Her2 will be provided. As significant as cancer is in human pathology, ischemic diseases are no less ignorable. Even though a majority of potential patients are conscious of prevention, not so many are familiar with self-diagnosis. The reason for this inconvenience is because no obvious symptoms appear when ischemia occurs. Therefore, in this study, development of an assay for examination of early myocardial ischemia (MI) was also performed. During MI, a state of lack of oxygen in the heart due to blockage of blood flow, many changes occur in the body including pH decrease, electrolyte imbalance, and eventually irreversible cell injury. In spite of the severe conditions, no obvious symptoms appear and therefore patients are usually unaware of their diseases. Because early treatment is critical in ischemia, diagnostic tools have been increasingly developed. Electrocardiograms were initially recorded, but as patients may also present normal cardiograms, detection of biomarkers are widely used in emergency departments. Among the markers, ischemia modified albumin (IMA) is considered by far the most trustworthy and accurate index for examining ischemia. IMA levels are elevated in plasma within a few minutes of ischemia onset and may last for up to 6 hours. Human serum albumin (HSA) has many ligand binding sites, and the N-terminal binding site (NTS) is where several metal ions such as cobalt, copper, and nickel bind. The amino acids essential for the binding of metals are Asp-Ala-His-Lys. By yet unspecified mechanisms, IMA is formed when MI occurs with the last two amino acids of the NTS (Asp-Ala) are cleaved. Therefore, metals that are originally able to bind to HSA are incapable of binding to IMA. With this principle, Bar-Or, et al. developed the albumin cobalt binding (ACB) test, which uses cobalt ions to indirectly measure IMA levels in patient plasma. However, Mothes, et al. discovered that cobalt does not mainly bind to the NTS and pointed out the inappropriateness of the ACB test in detecting IMAs. In this study, copper, nickel, and iron were additionally analyzed for binding to the tetrapeptide (DAHK) of the HSA N-terminus. Through liquid chromatography and mass spectrometry, we confirmed that copper was the best binding metal ion to the tetrapeptide, and searched for copper-specific detection reagents. Lucifer yellow (LY) was able to selectively detect copper. A novel albumin copper binding (ACuB) assay was developed and validated with linearity and in vivo plasma samples. Unlike the ACB test, ACuB assay is expected to not give false results of IMA levels because copper has no known binding sites in HSA other than the NTS. Although this study is only preliminary and more research on the mode of action is needed, we anticipate practicability of the ACuB assay in the near future.;위암은 사망률이 세계적으로 가장 높은 암임에도 불구하고 아직 명확한 치료법이 알려져 있지 않다. 그 발병률은 개인의 환경 및 상태에 따라 다양하지만, 조기진단 및 조기치료의 필요성은 공통적으로 해당된다. Her2는 다양한 신호전달경로를 활성화시킴으로써 세포 생존에 관여하며 상피성장인자수용체(EGFR)에 속하는 막관통수용체이다. Her2는 특이하게도 알려진 리간드가 없기 때문에 정상적인 발현 수준에서는 동형2합체 또는 다른 EGFR 구성원 단백질들과 이형2합체를 형성하며 활성화된다. 하지만 암세포에서 과발현이 될 경우 동형2합체가 필요 이상으로 형성되면서 특정 자극이 없어도 활성화될 수 있다. 결국에는 보다 더 강한 생존력을 갖게 해 항암치료에 방해를 주며, Her2의 활성화 조절은 항암화학요법에 필수불가결하다. 현재 가장 많이 쓰이고 있는 Her2를 표적으로 하는 약품은 trastuzumab (Herceptin)이며, 미국 식품의약품안전청에서 가장 처음 승인 받은 의약품이다. 이는 Her2의 세포외영역을 인지하는 항체이며 Her2 과발현 유방암세포에서 효능이 좋은 것으로 증명되었다. 하지만 1년 이내에 내성이 생긴다는 단점과 심장독성의 심각한 부작용이 있어 Her2가 과발현되어 있는 환자만 엄격히 선정하여 사용되고 있다. 현재는 이 약품의 효능을 향상시키기 위해 많은 연구가 이루어지고 있다. Calpain은 세포질에 존재하는 단백질가수분해효소로, 이 또한 세포 증식과 관련하여 많은 신호경로를 조절한다고 알려져 있다. 최근에는 calpain의 다양한 역할 중 암 조절경로에 대한 연구가 가장 활발히 진행되고 있다. 이 효소의 수 많은 기질 중의 하나인 p27kip1은 cyclin-dependent kinase (Cdk)의 억제제이다. p27kip1은 원활한 세포 주기에 필수적인 cyclin-Cdk 복합체의 형성을 억제함으로써 세포 증식을 막는다. p27kip1 발현 수준은 calpain 뿐만 아니라 trastuzumab과도 연관성이 있다는 연구들을 기반으로, 본 연구에서는 calpain의 억제가 Her2 양성 및 음성 위암세포에서 나타내는 서로 다른 동향에 대하여 알아보았다. 더욱 많은 연구가 필요한 분야이지만 본 학위논문의 결과를 토대로 calpain과 Her2의 관계에 대하여 보다 깊이 있는 통찰력을 가질 수 있을 것이다. 인간 질병에 있어 암도 중요하지만 허혈성 질환의 중요성 또한 무시할 수 없다. 허혈성 질환의 예방법에 대하여서는 많은 환자들이 의식하고 있지만 진단법에 대해서는 무지한 경우가 많다. 이러한 이유에는 허혈이 일어나도 뚜렷한 증상이 나타나지 않는다는 점에 있다. 그러므로 본 연구에서는 허혈성 심질환을 진단할 수 있는 시험법의 개발하고자 하였다. 혈류의 막힘으로 인해 심장에 산소가 부족 할 때 나타나는 심근허혈이 오면 체내에서는 pH 감소, 전해질 불균형, 비가역성 세포손상 등의 많은 변화들이 일어난다. 이러한 심각한 상태가 진행됨에도 불구하고 겉으로 뚜렷한 증상이 나타나지 않기 때문에 환자들은 종종 그들의 질병을 자각하지 못한다. 허혈성 질병은 조기치료가 매우 중요한데, 최초의 진단방법이었던 심전도만으로는 정확한 진단이 어려워 생물지표의 측정 또한 많이 이루어지고 있다. 그 중 허혈변성알부민(ischemia modified albumin, IMA)은 발병 후 수 분 내에 혈장에서 증가하고 그 수준은 6시간까지 지속되므로 가장 적절하고 정확한 지표로 생각되고 있다. 사람혈청알부민(human serum albumin, HSA)에는 다양한 리간드가 결합할 수 있는데, N-말단 부위에는 코발트, 구리, 니켈 등의 금속이온이 결합한다. 결합에 결정적인 역할을 하는 아미노산은 Asp-Ala-His-Lys인데, 심근허혈이 발병하면 Asp-Ala 부위가 잘려 나가면서 IMA가 형성된다. 정확한 형성 기전은 아직 밝혀지지 않았지만 현재 응급병동에서는 신속한 IMA 측정을 위하여 Bar-Or, et al.이 개발한 알부민코발트결합시험법(albumin cobalt binding (ACB) test)을 시행하고 있다. 이는 코발트를 이용하여 간접적으로 IMA를 측정하는 실험방법인데, 흥미롭게도 Mothes, et al.이 코발트의 주 결합부위는 HSA의 N-말단 부위가 아니라 다른 곳이라는 점을 밝히면서 ACB test의 부적절성에 대하여 논한 바 있다. 본 연구에서는 크로마토그래피와 질량분석을 통하여 여러 금속이온 중 구리가 HSA N-말단의 네 아미노산에 가장 큰 결합력을 갖는다는 것을 확인하였다. 이후에 구리를 측정할 수 있는 시약을 검토하여 lucifer yellow (LY)가 구리를 특이적으로 감지할 수 있었고, 이 성질을 이용하여 새로운 분석방법을 개발하였으며, 이를 알부민구리결합시험법(albumin copper binding (ACuB) assay)이라 명명하였다. 완성된 분석법의 직선성을 검토하였고, 동물 시료를 이용하여 임상에서의 쓰임이 타당한지를 입증하였다. 구리는 HSA N-말단 외의 다른 결합부위가 알려져 있지 않기 때문에 ACB test와는 달리 ACuB assay는 N-말단이 손상된 IMA를 측정하는데에 적합하다. 비록 본 연구는 예비단계이며 작용 기작에 대하여 보다 많은 연구가 필요하지만, ACuB assay의 실현 가능성은 기대되는 바이다.