Inhibition of β-catenin to overcome endocrine resistance in tamoxifen-resistant breast cancer cell line

Abstract

Endocrine therapy is an effective and well-tolerated targeted therapy for estrogen receptor (ER)-positive breast cancer. The most commonly used endocrine therapy agent is the selective ER modulator tamoxifen. However, primary or acquired endocrine resistance to this agent is an obstacle to the treatment of ER-positive breast cancer. The most well-known mechanism of endocrine resistance is cross-talk between the ER and other growth factor signaling, such as phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/Akt and the mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling pathway. β-catenin signaling is important in cell growth and differentiation and is frequently dysregulated in various cancers. In the present study, I found that the expression and transcriptional activity of β-catenin were increased in tamoxifen-resistant breast cancer cell line (TamR). The inhibition of β-catenin by the small molecular inhibitor ICG-001 reduced the viability of TamR cells and downregulated the cell-cycle regulator cyclin D1. The combination of ICG-001 and rapamycin, an mTOR inhibitor, yielded an additive effect on the viability of TamR cells. First, I established TamR cells via long-term exposure of MCF-7 breast cancer cells to gradually increasing concentrations of tamoxifen. TamR cells showed a more elongated morphology, such as a mesenchymal phenotype, and increased resistance to tamoxifen compared with control cells. TamR cells exhibited a relatively decreased expression of ER and increased expression of the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) and the epidermal growth factor receptor (EGFR). Second, I analyzed the expression of β-catenin using western blotting and its transcription activity using a luciferase reporter assay. The expression and transcriptional activity of β-catenin were increased in TamR cells compared with control cells. ICG-001 effectively inhibited the expression and transcriptional activity of β-catenin in a dose-dependent manner. Third, I measured cell viability after treatment of TamR cells with ICG-001 and rapamycin. The cell viability decreased by 65.3%, 68.3%, and 81.7% after treatment with ICG-001, rapamycin, and a combination of ICG-001 and rapamycin, respectively. The combination of the two drugs yielded an additive effect on the viability of TamR cells. Despite the suppression of ER expression, the expression of cyclin D1 was maintained at a considerable level in TamR cells. The expression of cyclin D1 was significantly decreased by ICG-001 and rapamycin. Fourth, I analyzed the expression of PI3K/Akt/mTOR and β-catenin-related molecules to obtain mechanistic insights. The expression and transcriptional activity of β-catenin were decreased to a greater extent after treatment with the combination of ICG-001 and rapamycin. The glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) is a critical enzyme that is associated with both the PI3K/Akt/mTOR and β-catenin pathways. The expression of pGSK-3β was decreased to the greatest extent by the combination of ICG-001 and rapamycin. In conclusion, these results suggest that β-catenin plays a role in tamoxifen-resistant breast cancer. The inhibition of β-catenin may be a potential therapeutic target in tamoxifen-resistant breast cancer.;유방암은 우리나라 여성에서 갑상선암 다음으로 가장 흔하게 발생하는 종양이다. 유방암은 호르몬 수용체와 인간상피세포성장수용체-2 (HER2) 에 따라 하위유형으로 분류된다. 이 중 호르몬 수용체 양성 유방암은 전체 유방암의 약 70-75% 정도를 차지하며, 이들 유방암에서 여성호르몬과 호르몬 수용체의 신호 전달 체계를 차단하는 타목시펜과 같은 항호르몬요법은 중요한 치료 중의 하나이다. 그러나 전이성 호르몬 수용체 양성 유방암으로 진단 받고 항호르몬요법을 받은 환자들의 약 반 정도는 초기부터 항호르몬제에 반응하지 않으며, 초기에 반응을 보였던 환자들도 평균 1년 정도 경과하면 병진행을 경험하게 되어 호르몬 저항성을 보이게 된다. 따라서 호르몬 저항성의 기전을 연구하고 이를 극복할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하다. 현재까지 알려진 가장 중요한 기전은 다른 성장인자수용체 신호전달체계와의 상호작용을 통한 활성화이며, 대표적인 것이 PI3K/Akt/mTOR 신호전달체계이다. β-catenin 신호전달체계는 세포의 성장, 분화, 발달 과정에 중요한 역할을 하며, 대장암을 비롯한 여러 암종에서 활성화 되어져 있고, 나쁜 예후와 연관이 있다고 알려져 있다. 유방암의 경우에는 호르몬 수용체와 HER2가 모두 음성인 삼중음성유방암에서의 역할에 대해 보고된 바가 있다. 본 연구에서는 호르몬 저항성 유방암에서 β-catenin의 역할에 대해 살펴보고, 이 신호전달체계를 억제함으로써 호르몬 저항성을 극복할 수 있는지를 알아보고자 하였다. 이를 위해 기존의 다른 연구에서 보고된 바와 같이, 호르몬 양성 유방암 세포주를 타목시펜 저농도에서 단계적으로 농도를 증가시키며 약 8개월 동안 장기간 노출된 상태로 계대배양하여 타목시펜 저항성 유방암 세포주를 획득하였다. 모세포의 경우 타목시펜 (3 µM)을 처리하면 세포 생존율이 감소한 반면, 타목시펜 저항성 유방암 세포주는 세포 생존율에 차이가 없었다. 또한 모세포에 비해 호르몬 수용체의 발현은 낮고, HER2와 상피세포성장인자수용체의 발현은 증가되어 있었다. β-catenin에 대한 분석은 Western blot을 이용한 단백질 발현 정도와 Luciferase assay를 이용한 전사 활성화 측정을 통하여 시행하였다. 타목시펜 저항성 유방암 세포주에서 모세포에 비해 β-catenin 단백질 발현과 전사 활성화가 증가되어 있었고, 이는 β-catenin 저해제인 ICG-001에 의해서 억제됨을 확인할 수 있었다. β-catenin의 억제를 통해 호르몬 저항성을 극복할 수 있는지를 확인하기 위해, ICG-001과 mTOR 저해제인 rapamycin 처리 후 세포생존율을 분석하였다. 타목시펜 저항성 유방암 세포주의 생존율이 ICG-001 처리 후 65.3%, rapamycin 처리 후 68.3%, 두 약물 동시 처리 후 81.7%에서 감소함을 확인할 수 있었고, CalcuSyn 프로그램을 이용하여 확인한 결과 두 약물은 첨가 효과를 보였다. Western blot을 이용한 단백질 발현 분석에서 두 약물을 동시에 처리한 경우 β-catenin의 발현이 가장 많이 감소하였고, PI3K/Akt/mTOR와 β-catenin 두 신호전달체계 모두에서 중요한 조절자로 알려져 있는 GSK-3β 활성이 두 약물 처리 후 가장 많이 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한, 이들 신호전달체계의 최종 표적 물질이자, 세포주기 진행에 관련된 cyclinD1의 발현이 두 약물 처리 후 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로, 본 연구를 통해 타목시펜 저항성 유방암 세포주에서 β-catenin의 단백 발현과 전사 활성이 증가되어 있음을 확인하였다. 또한, β-catenin의 억제를 통해 타목시펜 저항성 유방암 세포주의 생존율이 감소함을 확인함으로써, β-catenin 저해제가 호르몬 저항성 유방암의 새로운 표적치료제가 될 수 있음을 제시하였다.