The effect of cholesterol on cardiac hypertrophy and its regulation by Ubiquitin-Proteasome System

Abstract

Cardiac hypertrophy leads to decompensated heart function, predisposition to heart failure, and sudden death due to physiological and pathological stimuli. Although high cholesterol is considered a principal risk factor for atherosclerosis and heart disease, it has not been shown whether cholesterol itself is sufficient to cause cardiac hypertrophy. In this study, I investigated whether cholesterol induces cardiac hypertrophy, and identified cellular mechanisms underlying hypertrophic responses using H9c2 cells as a model system. I showed that loaded cholesterol significantly increased cell surface area and upregulated hypertrophic growth marker gene, β-myosin-heavy chain (β-MHC). Indeed, it activated the phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/AKT pathway and extracellular signal-regulated kinase (ERK)/mitogen activated protein (MAPK). In contrast, these hypertrophic growth were significantly reduced by LY294002, a PI3K kinase inhibitor. Together, cholesterol could have main key role in the development of cardiac hypertrophy through the activation of the PI3K/AKT pathway activation. Next, I focus on suppression of cholesterol-induced cardiac hypertrophy. A recent study showed that proteasome inhibitors may suppress cardiomyocyte hypertrophy, even though the mechanisms are not clear. Therefore, I examined the effect of proteasome inhibitors on the cholesterol-induced hypertrophic growth in H9c2 cells to observe whether UPS is involved in the cardiac hypertrophy. The treatment of proteasome inhibitors, MG132 and Bortezomib, markedly reduced cellular surface area and mRNA expression of β-MHC in cholesterol-induced cardiac hypertrophy. Indeed, activated AKT and ERK was significantly attenuated by MG132 and Bortezomib in cholesterol-induced cardiac hypertrophy. MG132 and Bortezomib also prevented cell cycle reentry by regulated G1/S phase transition. Together, I found that cholesterol can induced cardiac hypertrophy through AKT pathway and cholesterol-induced cardiac hypertrophy was suppressed by proteasome inhibitors (MG132 and bortezomib). Following these suppressive effects of proteasome inhibitors, I developed a method for monitoring the degradation and accumulation of UPS-dependent substrates in cells using CE with dual LIF. I used a green fluorescent protein (GFP)-fusion of the ubiquitin substrate ribophorin 1 (GFP-RPN1) along with red fluorescent protein (RFP) as an internal control to normalize transfection efficiency. They were detected without any interference or crosstalk. The intensity of GFP-RPN1 fluorescence was normalized to that of RFP. Additionally, the proposed approach was used successfully to detect the degradation of GFP-RPN1 and evaluate proteasome inhibitors. These results show that the developed method is effective and promising for rapid and quantitative monitoring of UPS-dependent substrates. Therefore, regulatory mechanism of cardiac hypertrophy by cholesterol and proteasome inhibitor may provide a new therapeutic strategy to prevent progression of heart failure.;심근 비대증은 병리적인 혹은 생리적인 자극들에 의해 심장 기능을 손실케 하고 심장마비를 일으켜 결국 죽음에 이르게 만드는 질병이다. 높은 콜레스테롤은 심장 관련 질병들과 아테롤성 동맥경화증에 주된 위험요소 이지만 콜레스테롤 자체가 심근비대증을 충분히 야기 시킬 수 있는지에 관해선 아직 밝혀진 바가 없다. 이 연구에서, 나는 콜레스테롤이 심근비대증을 유발하는지 그렇다면 세포 내 어떤 기작을 통해서 심근비대증을 유발하는지에 관해 심근 세포인 H9c2 세포를 이용하여 밝혔다. 나는 콜레스테롤을 심근세포에 처리를 하였을 시, 세표 표면 면적이 상당히 넓어지는 것을 확인하였고, 비대성의 성장 마커 유전자인 β-myosin-heavy chain (β-MHC)의 mRNA발현도 대조군에 비해 월등히 증가하였다. 게다가, 심근세포인 H9c2세포에 콜레스테롤 주입은 phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/AKT pathway 과 extracellular signal-regulated kinase (ERK)/mitogen activated protein (MAPK)을 활성화시켰다. 반대로 이 비대성 성장은 LY294002라는 PI3K kinase inhibitor를 처리시 상당히 유의적으로 세포 표면 면적 감소, 마커 유전자 발현 감소, 신호전달 단백질의 활성 감소로 인하여 억제 되는 것을 밝혔다. 다음으로 나는 콜레스테롤이 유발하는 심근 비대증의 억제 기작에 초점을 맞추었다. 최근 많은 연구들이 그 기작은 확실하지 않을지라도 프로테아좀 억제제가 심근세포의 비대성 성장을 억제 가능케 한다는 보고가 되고 있다. 그래서, 나는 Ubiquitin Proteasome System (UPS)가 심근 비대증과의 관계를 밝히기 위해 프로테아좀 억제제가 콜레스테롤이 H9c2세포에서 심근 비대증을 유발하는데 미치는 효과를 연구하였다. 프로테아좀 억제제인 MG132와 Bortezomib을 처리시, 콜레스테롤에 의해 증가되었던 세포표면 면적은 상당히 줄어들었고, 마커 유전자인 β-MHC의 mRNA발현도 학연히 감소 되었다. 게다가 콜레스테롤에 의해 증가되었던 AKT와 ERK 활성이 MG132와 Bortezomib을 통해 월등히 줄어들었다. MG132와 Bortezomib은 또한 세포주기중 G1/S 단계를 이행함으로써 세포주기가 재진입 하는 것을 막는다. 이 결과들을 종합하여, 나는 콜레스테롤은 AKT신호전달 체계의 활성에 의해 심근 비대증을 유발하고, 이들은 프로테아좀 억제제인 MG132와 Bortezomib에 의해 억제 됨을 밝혀냈다. 나는 프로테아좀 억제제의 억제효과에 초점을 맞추어, UPS에 의존하는 기질의 세포내 축적이나 분해를 모세관 전기영동 이중 형광 레이져를 이용해 모니터링 하는 방법을 구축하였다. 나는 이 실험을 위해 green fluorescent protein (GFP)-fusion 에 ubiquitin 기질 ribophorin 1 (GFP-RPN1) 이 하나로 된 퓨전유전자를 사용하고, 세포내 유전자 주입시마다 달라지는 효율성을 보완하고 red fluorescent protein (RFP) 를 컨트롤로 사용하였다. 이 두개의 형광 유전자는 서로의 간섭이 없이 잘 검출 되었다. GFP-RPN1의 형광 강도는 RFP형광 강도에 의해 보정 되었다. 게다가, 이 기술은 GFP-RPN1의 UPS의존한 단백질 분해와 프로테아좀 억제제를 평가하는데 검출방법으로 사용 가능하였다. 이 결과들을 종합하여, 이 새로운 실험방법은 충분히 효과적이고 간단히 정량적으로 UPS의존 기질의 활성을 모니터링 할수 있음을 밝혀내었다. 콜레스테롤과 프로테아좀 억제제에 의한 심근비대증 조절 기작은 심장마비 진행을 막는 새로운 치료상의 전략이 될 수 있을 것이다.