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dc.contributor.advisor이윤실-
dc.contributor.author강가영-
dc.creator강가영-
dc.date.accessioned2016-08-26T04:08:43Z-
dc.date.available2016-08-26T04:08:43Z-
dc.date.issued2015-
dc.identifier.otherOAK-000000111868-
dc.identifier.urihttps://dspace.ewha.ac.kr/handle/2015.oak/212241-
dc.identifier.urihttp://dcollection.ewha.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000111868-
dc.description.abstract암 치료의 최종 목적은 정상세포보다 암세포를 죽이는데있다. 암세포의 분화 과정은 정상세포보다 빠르게 일어나기 때문에, 항암제의 대부분은 세포주기 조절을 타켓으로 한다. DNA 에 손상을 주어 암세포의 죽음을 이끈다. 하지만, 미처 암세포가 죽기 전에 DNA 회복 유전자에 의해서 회복되게 된다. 그 과정 중에 부정확하고 비정상적인 회복이 발생하게 되면, 유전자 불안정성의 증가로 암세포는 더욱 활성화된다. 유전자 불안정성은 대부분의 암에서 나타나며, DNA 복구 유전자와 밀접한 관계를 보이고 있다. 특히, 방사선에 의한 유전자 복구 기작으로 non-homologous end joining (NHEJ) 가 대표적이다. DNA 복구 유전자가 암진행에 중요한 역할을 하지만, 아직까지 정확하게 DNA 복구 유전자의 암진행에 끼치는 기전에 대해서 밝혀진 바가 없다. Part I 에서는 HSF1과 DNA 복구 유전자인 Ku70 과 Ku86이 결합함을 밝혔고, 결합 위치는 모두 N-terminal domain 임을 제시한다. 또한, 방사선을 쪼였을 때, HSF1-Ku70과 HSF1-Ku86의 결합은 Ku70과 Ku86의 결합을 방해함으로써, 방사선에 의한 손상의 회복을 저해 할 뿐만 아니라, 유전자 불안정성을 유발한다. 하지만, 이 기작은 HSF1의 전사적 생산물인 열 충격 단백질과는 무관하게 일어나며, HSF1 인산화와에도 관련이 없다. 이 연구는 기존에 많이 주장 되고 있는 HSF1의 암진행 기작을 규명함에 의의가 있다. PART II에서는 기존에 Snail1 과 DNA-PKcs 의 결합을 보여준 논문을 기반으로 진행되었다. Snail1 과 Slug의 공통의 아미노산 펩타이드 (SP)를 처리를 통해서, Snail1-DNA-PKcs 의 결합이 떨어짐을 규명하였으며, 이로 인해 Snail1 의 phosphorylation 이 감소하여, Snail1의 stability 가 떨어져, tumor metastasis가 저해됨을 확인하였다. 또한, DNA-PKcs 기능의 회복으로 유전자 복구 기작의 회복과 유전자 불안성의 감소를 확인하였다. SP 에 의해 나타나는 기작은 DNA-PKcs 가 존재할 경우에만 효과가 나타난다. 또한, SP 처리로 방사선에 대한 민감성의 커져서 암세포의 사멸 현상 나타나는 것을 확인하였다. 이는 p53 의존적인 양상을 보인다. 이의 연구들을 토대로 DNA 복구 유전자와 관련있는 유전자를 찾아내고, 유전자들의 새로운 기능을 밝힘으로써, 암 연구에 대한 또 다른 전략적인 방안을 제시한다.;Previously, we reported that HSF1 is phosphorylate by Plk1 in mitosis, and that prolonged Plk1-mediated HSF1 phosphorylation affects the metaphase to anaphase transition and produces aneuploidy in functional p53- defective cells through a mechanism independent of the transcriptional activation of HSF1. Here we further identified a novel role for HSF1 as an inhibitor of NHEJ repair. HSF1 interacted directly with both of the Nterminal sequences of the Ku70 and Ku86 proteins, which resulted in inhibition of the endogenous heterodimeric interaction between Ku70 and Ku86. This HSF1-mediated blocking of the Ku70 and Ku86 interaction induced defective DNA repair activity and ultimately resulted in genomic instability after ionizing radiation (IR), which was similar to effects seen in Ku70 or Ku80 knockout cells. The binding activity between HSF1 and Ku70 or Ku86 was dependent on DNA damage response such as IR exposure, but not on the heat shock mediated transcriptional activation of HSF1. Moreover, the phosphorylation status of HSF1 did not affect the binding activities of HSF1-Ku70 or HSF1-Ku86. Furthermore, the defect in DNA repair activity mediated by HSF1 was observed regardless of p53 status. Rat mammary tumors derived using dimethylbenz(a)anthracence revealed that high levels of expression of HSF1 interfere with the binding of Ku70-Ku80. This data suggests that HSF1 interacts with both Ku70 and Ku86 to induce defective DNA repair activity and genomic instability, which in turn suggests a novel mechanism of HSF1-mediated cellular carcinogenesis.-
dc.description.tableofcontentsPART I 10 ABSTRACT 11 I. INTRODUCTION 12 II. MATERIALS AND METHODS 26 Plasmids 26 Cell Culture 26 Immunoblotting and Immunoprecipitation 26 Chemicals and Reagents 27 Cell Transfection 27 Linear dsDNA-associated Protein Pull-down Assay 27 Flow Cytometry 27 Ionizing Radiation Treatment 28 In vitro Translation Analysis 28 Cytosol/Nuclear Fraction 28 Immunofluorescence Analysis 28 In vitro Protein-binding Assay 29 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 29 Comet Assay 29 Immunohistochemistry 30 Spontaneous Mammary Tumor Development and Histological Examination 30 Statistical Analysis 31 III. RESULTS 32 HSF1 inhibits damage repair activity and protects IR-induced cell death 32 HSF1 interacts with both Ku70 and Ku86 38 HSF1 inhibits binding activity between Ku70 and Ku86 43 Knockout of Ku70 or K80 results in similar patterns of HSF1 overexpression with defective DNA repair and aneuploidy formation 49 HSF1-mediated defective repair activity is dependent of its transcriptional activity 55 p53 status does not affect the HSF1-Ku70 or HSF1-Ku86 interactions 59 HSF1 expression correlates with aggressive malignancy and negative binding activity of Ku70-Ku80 in rat mammary tumors 63 IV. DISCUSSION. 68 PART II 70 ABSTRACT 71 I. INTRODUCTION 72 II. MATERIALS AND METHODS 76 Plasmids 76 Cell Culture and Transfection 76 Immunoblotting and Immunoprecipitation 77 Irradiation 77 DNA-PKcs Kinase Assay 78 Ubiquitination Assay 78 E-cadherin Promoter Assay 78 Migration Assay 79 Linear dsDNA-associated Protein Pull-down Assay 79 Immunofluoresecence Analysis 80 Cell Cycle Anlaysis 80 Comet Assay 80 Lung Colonization Assay 81 Statistical Analysis 81 III. RESULTS 82 SP inhibits interaction which DNA-PKcs binds both Snail1 and Slug 82 SP activates DNA repair activity and inhibits DNA-PKcs-mediated Snail1 phosphorylation at Ser-100 after IR 86 Phosphorylation of Snail at Ser-100 is blocked by SP, which results in Snail protein degradation by the ubiquitination pathway 90 SP increases E-cadherin promoter activity and inhibits tumor migration 96 SP sensitizes IR-mediated cell death 102 Effects of SP is a p53 dependent manner 105 IV. DISCUSSION 110 REFERENCE 112 APPENDIX 120 국문초록 121 ACKNOWLEDGEMENTS 124-
dc.formatapplication/pdf-
dc.format.extent7649895 bytes-
dc.languageeng-
dc.publisher이화여자대학교 대학원-
dc.subject.ddc600-
dc.titleNovel functions of HSF1 and Snail1 in DNA-damage response-
dc.typeDoctoral Thesis-
dc.creator.othernameKang, Ga Young-
dc.format.pageix, 128 p.-
dc.contributor.examiner권영주-
dc.contributor.examiner이재선-
dc.contributor.examiner이윤실-
dc.contributor.examiner이윤진-
dc.contributor.examiner차혁진-
dc.identifier.thesisdegreeDoctor-
dc.identifier.major대학원 약학과-
dc.date.awarded2015. 2-
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