새로운 피부감작·자극 대체법의 대체가능성 연구

Abstract

The purpose of the study is validation of two alternative methods, LLNA:BrdU-FCM and KetaskinTM-VM test method with regard to reproducibility and predictive capacity. The LLNA:BrdU-FCM method is the me-too method of LLNA which can assess chemicals as skin sensitizer and non-sensitizer. The other alternative method, KeraskinTM-VM method, is me-too method of assessing skin irritant and non-irritant. The major recommendation of validation on this study is OECD Test Guideline for alternative methods. If the results of methods are satisfied with OECD recommendations, the alternative methods would be replaceable. In LLNA:BrdU-FCM method, EC3 (estimated concentration 3) of HCA and DNCB should be in acceptable range to assess its within- and between-laboratory reproducibility. The LLNA PS are based on the variability of results from repeated tests of HCA. Acceptable intra(within)-laboratory reproducibility is ECt values between 5% and 20%, which represents the range of 0.5-2.0 times the mean EC3 specified for HCA (10%) in the LLNA. To demonstrate acceptable inter(between)-laboratory reproducibility, each laboratory should obtain ECt values of 5% to 20% for HCA and 0.025% to 0.1% for DNCB, which represents the range of 0.5-2.0 times the mean EC3 concentrations specified for HCA (10%) and DNCB (0.05%), respectively, in the LLNA In the multi-laboratory pre-validation of the KeraskinTM-VM model presented in this validation study, 20 chemicals were tested in 3 different laboratories according to OECD TG 439. However, there is a limitation in OECD Test Guideline because statistical recommendation is not included in assessing reproducibility. Therefore, further statistical analysis for assessing reproducibility was followed. On this study, several statistical methods that are descriptive statistics and inferential statistics were used to assess within- and between-laboratory reproducibility. The descriptive statistics represents mean and standard deviation of results which are Stimulation Index (SI) values of LLNA:BrdU-FCM methods Cell Viability of KeraSkinTM-VM method. One of the inferential statistics is one-way analysis of variation (ANOVA) used for comparing means of trials or labs. Kruskal-Wallis is a non-parametric method of comparing more than three groups when the number of data is not large enough to use parametric method. Additionally, assumptions which must be validated before parametric method were conducted. In addition, the other statistical analyses were conducted in KeraSkinTM-VM. The within- and between-laboratory reproducibility were evaluated by Fleiss’ Kappa test and IntraClass Correlation. The other goal is to evaluate whether the two alternative methods are able to assess proper classification as sensitizer or irritant. In LLNA:BrdU-FCM method, the SI values which are same and over threshold (SI=3) are classified as skin sensitizer. In KeraSkinTM-VM method, skin Irritations are classified as those chemicals under the value of cut-off (cell viability 50%). Predictive capacity which represents sensitivity, specificity and accuracy can be compared to traditional test methods. The two alternative methods, LLNA:BrdU-FCM and KeraSkinTM-VM, could be replaceable because the criteria, reproducibility (reliability) and accuracy, are nearly satisfied with limitations.;본 연구의 목적은 비방사능 동위원소 물질 (non-radioisotope)을 사용하여 피부감작성을 판단하는 새로운 대체법인 LLNA:BrdU-FCM방법과 동물실험 대신 in vitro 에서 시행하여 피부자극성을 판단하는 새로운 대체법인 KeraSkinTM-VM 방법의 실험결과값을 이용하여 이 새로운 시험법들이 기존의 시험법을 대체 가능한지 검증하였다. Part 1. LLNA:BrdU-FCM 현재, The murine local lymph node assay (LLNA) 는 OECD Test Guideline 429 (OECD)에서 인정한, 물질의 피부 감작성을 평가하는 기법이다 (Basketter et al., 1999). 그러나 LLNA 방법은 방사선 동위원소 (3H-thymidine)를 사용하여 그 활용도가 제한이 있을 수 있다 (Omori et al., 2008). 한편, LLNA:BrdU-FCM기법은 LLNA에 대한 비 방사선 (non-radioisotopic) 방법으로서 국내에서 개발되었다(Jung et al., 2012). LLNA:BrdU-FCM법은 전통적인 LLNA와 시험이론이 유사하여 OECD TG 429에서 제안하는 me-too test method의 검증을 위한 Performance standard에 따라, 3개 기관이 참여하여 2개의 양성대조물질, HCA와 DNCB에 대해 각각 4회, 3회 반복 실험하였다. 본 연구에서는 그 결과를 바탕으로 재현성 기준을 만족하는지 여부를 기술 통계와 추론 통계 방법 등의 다양한 통계 방법으로 확인하였다. 또한, OECD에서 지정한 18개의 참조물질을 감작성, 비감작성 물질로 판정하여 기존의 시험법과 판정이 일치 (concordant)하는지를 정확도 (accuracy) 수치로 확인하였다. Part 2. KeraSkinTM-VM 이 논문에서 대체가능성을 연구한 두 번째 시험법인 KeraSkinTM-VM 방법은 동물을 사용하지 않고, in vitro에서 물질의 피부 자극성을 평가하는 기법으로 한국 사람의 표피에서 추출한 세포 모델을 사용하여 국내에서 개발되었다. OECD guideline Test Guideline 439 (OECD)에서 제안하는 유사, 변형된 시험 기법의 검증 기준을 만족한다면, 새로운 대체시험법의 대체 가능성이 검증될 수 있다. Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS) 범주에 따라 독립적인 세 기관에서 20개의 화학 물질을 평가하고 분류하였다. 본 연구에서는 그 결과를 바탕으로 재현성 있는 결과가 도출되었는지의 여부를 기술 통계와 추론 통계 방법 등 다양한 통계 방법으로 확인하였다. 또한, 20개의 참조물질을 자극성, 비자극성 물질로 판정하여 기존의 시험법과 판정의 일치 (concordant) 여부를 정확도 (accuracy) 수치로 확인하였다.