Arrest Defective Protein 1 Regulates Cell Cycle via 14-3-3γ

Abstract

Arrest defective protein 1(ARD1)은 yeast에서 세포주기와 포자형성을 조절하는 것으로 처음 알려졌으며, N-acetylatransferase의 기능을 가진다. 최근 보고에서 ARD1이 cyclin D1을 증가시켜서 폐암세포에서의 세포증식을 촉진한다는 것이 알려졌다. 반면, ARD1은 TSC2를 아세틸화시켜 TSC2/mTOR 신호를 조절하여 유방암 세포의 증식을 억제한다고 알려져 있다. 세포주기와 관련한 이전 보고에서 hARD1 siRNA를 처리한 세포에서 세포 증식이 억제되고 G0/G1 세포주기에 정지하는 것을 확인하였다. ARD1이 세포증식과 세포주기에 중요한 역할을 하는 단백질이지만, 세포주기 조절과 관련한 분자적인 기전에 대해서는 아직 많이 알려지지 않았다. 본 연구에서는, 2-DE 분석과 MS/MS 분석을 통해서 Ard1 유전자가 없는 줄기세포와 대조군 줄기세포에서 69개의 차이 나는 단백질을 확인하였고, 대조군에 비해서 46개의 단백질이 증가, 10개의 단백질이 감소하는 것을 확인하였다. 이렇게 확인된 단백질들을 세포주기, 세포증식, 대사, 발생과정, 세포사멸, RNA 공정, 신호전달, 단백질 이동과 같은 세포기능에 따라 분류하였다. 본 연구에서는 세포주기를 조절하는데 ARD1의 새로운 타겟으로서 14-3-3γ에 초점을 맞췄다. 면역 염색을 통해 ARD1이 14-3-3γ와 세포질에서 결합하는 것을 확인하였고 siRNA를 이용한 Ard1 knockdown된 세포에서 14-3-3γ가 프로테아좀을 통하여 단백질 분해가 되는 것을 확인하였다. 결과적으로, ARD1 단백질이 knockdown된 293T 세포에서 G0/G1로의 세포주기 증가와 G2/M로의 세포주기 변화가 감소하는 것을 확인하였고, 14-3-3γ가 감소되었을 때도 같은 결과를 확인하였다. 따라서 ARD1은 14-3-3γ과 결합하고 안정성에 관여함으로써 세포주기 조절에 작용하는 것을 알 수 있었다.;Arrest defective protein 1 (ARD1) was initially identified as an N-acetyl-transferase in yeast, regulating cell cycle and sporulation. Recent studies have shown that ARD1 upregulates cyclin D1 and promotes lung cancer cell proliferation by inducing ε-acetylation of β-catenin. On the other hand, it was reported that ARD1 induced α-acetylation of TSC2, and suppressed breast cancer cell growth by regulating TSC2/mTOR signaling. Related to cell cycle, previous studies have shown that hARD1 silencing RNA inhibited cell proliferation and induced cell cycle arrest. Although ARD1 plays an important role in regulating cell proliferation and cell cycle, the molecular mechanism of cell cycle control remains largely unclear. In this thesis, among differential 69 spots, 46 down-regulated proteins and 10 up-regulated proteins were identified in Ard1-/- ES cells comparable in Ard1+/+ ES cells by 2-DE and MS/MS analysis. These proteins are categorized according to their cellular function such as cell cycle, cell proliferation, metabolism, developmental process, apoptosis, RNA processing, signal transduction, and transport. In this study, I focused on a 14-3-3γ protein as a new target of ARD1 in cell cycle control. I determined that ARD1 bind 14-3-3γ in the cytoplasm. I also investigated deletion of Ard1 using siRNA decreased 14-3-3γ expression level through proteasomal degradation. In addition, the population in G0/G1 phases was increased and that in G2/M phases was reduced in Ard1 knockdown 293T cells. And same result in cell cycle control was shown in 14-3-3γ knock down cells. Thus, I suggest that ARD1 regulates cell cycle though 14-3-3γ.