Aqueous extract of Acanthopanax divaricatus var. chiisanensis attenuates hypertension by eNOS dependent vasodilation

Abstract

High blood pressure is one of the most important modifiable risk factors for cardiovascular disease. Many emerging evidence indicate that an array of plants might have a potential to regulate blood pressure by various mechanisms. Acanthopanax is a traditional medicinal plant widely used to treat various diseases in Asian countries. This study investigated the antihypertensive effects of Acanthopanax extract (AE) and its active compound, Acanthoside-D (AD) in in vivo and in vitro study. Male Spontaneously hypertensive rats (SHRs, n=60) and Wistar-kyoto rats (WKY, n=10) were randomly divided in 7groups (n=10/group); WKY normal cholesterol diet without AE; WN, SHR normal cholesterol diet without AE; SN, SHR high cholesterol diet without AE; SH, SHR HC diet with AE at a dose of 150, 300, 600 mg/kg B.W.; SH_L, SH_M, SH_H, and SHR HC diet with Acanthoside-D at a dose of 600 µg/kg B.W.; SH_D. AE or AD were given by oral gavage for 14weeks and their blood pressure was recorded weekly. Blood pressure was significantly reduced in SH_H group compared to the SH group at 10 week (p<0.0001) until 14 week (p=0.0003), also statistically significant decrease in SH_M group observed at 14 week (p=0.0003). Consistent with this, comparing to SH group, reduction in group of SH_H arterial wall thickness was measured by H&E staining (0.85-fold change) and an activation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) by immuno-fluorescence staining. To confirmed the in vivo study, nitric oxide (NO) production in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was measured using the fluorescent probe DAF-2 for direct determination of NO. AE induced a significant increase dose-dependently in DAF-2 fluorescence as compared with vehicle (p<0.001). Furthermore, a significant increase in eNOS phosphorylation was found when HUVECs were treated with high dose of AE (p<0.05) and dose-dependent tendency in PI3-kinase phosphorylation. Taken together, the results provide a basis for the use of AE in regulating blood pressure by enhancing endothelial function in a nitric oxide-dependent mechanism.;본 연구에서는 지리산오가피 열수추출물 (Acanthopanax divaricatus var. chiisanensis aqueous extract, AE)과 활성 물질인 acanthoide-D (AD)의 혈압증가억제 효과를 본태성 고혈압 동물 모델 (Spontaneously hypertensive rats, SHRs)을 통해 확인하였고, 그 기전을 인체 제대정맥 내피세포 (Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)를 통하여 규명하였다. 수컷 본태성 고혈압 흰쥐 (SHR)와 정상혈압 대조군 흰쥐 (WKY)를 초기혈압수치에 따라 난괴법으로 정상혈압-정상식이군 (WN), 고혈압-정상식이군 (SN), 고혈압-고콜레스테롤식이군 (SH), 고혈압-고콜레스테롤-오가피저용량군 150mg/kg B.W. (SH_L), 중용량군 300mg/kg B.W. (SH_M), 고용량군 600mg/kg B.W. (SH_H) 그리고 단일물질군 600µg/kg B.W. (SH_D) 총 7그룹으로 나누었다. 14주간 AE, AD 또는 음용수를 경구투여를 통하여 공급하였고, 매주 수축기 혈압 변화를 관찰하였다. 오가피 투여 10주 후부터 고용량군 (SH_H) 에서 혈압이 유의적으로 낮아지기 시작하여 `14주까지 지속되었으며, 14주 부터 중용량군의 수축기 혈압이 오가피를 투여하지 않은 군 (SH)의 혈압에 비하여 유의적으로 감소하였다. 본 연구에서는 오가피의 혈압조절 기능의 기전으로 레닌-안지오텐신 시스템 (Renin-angiotensin system, RAS) 과 산화질소 (nitric oxide, NO) 생성능 두 기전을 고려하였다. 오가피의 레닌-안지오텐신 시스템에 미치는 영향을 확인하기 위한 지표로 혈장 안지오텐신 II 농도 (Systemic RAS)를 측정한 결과, 오가피의 효과를 확인하기 어려웠다. 하지만, 동맥조직의 형태학적 분석에서 오가피 대조군 (SH)과 비교하여 오가피 고용량군 (SH_H)의 동맥두께가 감소하는 것을 확인 할 수 있었고, 면역 형광 염색법을 통하여 내피세포 산화질소 합성효소 (eNOS) 의 발현이 증가함을 관찰 하였다. In vivo 연구를 바탕으로 오가피의 혈압을 조절하는 메커니즘을 규명하고자 in vitro 연구를 인체 제대정맥 내피세포 (HUVECs) 를 이용하여 진행하였다. HUVECs 에 오가피 (AE)와 단일물질 (AD)을 처리한 후, NO 생성량을 DAF-2 실험을 통해 확인한 결과, 오가피를 투여함에 따라 농도의존적으로 유의적인 증가를 나타냈으나, 단일물질에서는 큰 차이를 발견할 수 없었다. 이를 토대로 단일물질보다는 오가피 자체로 섭취할 때 큰 의미를 지녔다. NO 생성량을 증가시키는 기전으로 NO를 생성하는 효소인 eNOS 의 발현정도를 웨스턴블랏을 통하여 확인하였다. 그 결과, eNOS의 활성형인 phosph-eNOS (p-eNOS) 의 발현이 증가되어 p-eNOS/eNOS의 비율이 오가피의 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가되는 것으로 나타났다. 또한 eNOS를 조절하는 upstream signaling pathway 인 PI3K 와 Akt 의 발현을 측정한 결과, p-PI3K/PI3K의 비율이 증가되는 오가피의 효과를 발견하였다. 각 기전의 중요한 길목에 위치한 단백질의 antagonist 인 L-NAME (eNOS receptor antagonist) 과 Wortmannin (PI3K/Akt antagonist) 를 미리 처리한 뒤 NO 생성능과 eNOS 발현효과를 확인해보니 오가피의 PI3K-Akt-eNOS 경로를 이용하여 NO 를 생성하는 혈관이완에 대한 효과를 검증할 수 있었다. 이상의 시험 결과를 바탕으로 하여 오가피의 혈압을 조절하여 고혈압을 개선시킬 가능성을 확인하였고, 이는 eNOS의 활성증가로 인한 NO 생성 증가에 의한 것으로 사료된다. 따라서 오가피 섭취에 따른 혈압 저하 효과는 고혈압 예방 및 혈압 조절을 위한 식품소재로서의 가능성을 보여주었으며, 이를 바탕으로 더 나아가 오가피의 혈관신생합성인자로서 혈압조절 관련 기전에 대한 추가연구가 필요할 것으로 보인다.