Simultaneous Detection of Thirteen Foodborne Pathogens Using Capillary Electrophoresis-Single Strand Conformation Polymorphism Coupled with Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification and Its Application in Foods

Abstract

식중독세균의 신속하고 정확한 진단은 식중독 사고의 예방과 관리를 위해 매우 중요하다. 특히, 식품 공급이 산업화, 국제화되고 식습관의 변화에 따라 외식과 대량 급식 산업이 증가됨에 따라 집단 식중독의 발생은 점점 대형화되고 있으며, 이는 막대한 경제적 손실과 사회적 파장을 일으킨다. 식중독으로부터 소비자를 안전하게 보호하기 위하여 식중독세균의 존재여부를 빠르고 민감하게 진단할 수 있는 미생물 검출시스템이 필요하다. 다양한 식중독세균의 검출 방법 중 핵산을 기반으로 분석하는 PCR(중합효소연쇄반응), microarray등과 같은 분자생물학적 진단 기술이 많이 사용되고 있다. 본 연구에서는 다중 라이게이션 기반 프로브 중폭 기술 (multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)을 모세관 전기영동 기반의 단일쇄 형태변환 다형성 (capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphisim, MLPA)을 적용하여 신속하고 정확하게 식중독 세균을 다중 검출하고자 하였다. 이를 위해 종 특이적인 유전자 영역을 대상으로 개별 균 주에 대한 특이적인 프로브를 디자인 하였다. 주요 식중독 세균 중 Bacillus cereus (groEL), Campylobacter coli (glyA), Campylobacter jejuni (hipO), Clostridium perfringens (plc), Cronobacter sakazakii (MMS), Enterococcus spp. (tuf), Escherichia coli O157:H7 (eaeA), Listeria monocytogenes (hly), Salmonella spp. (inv), Shigella spp. (ipaH), Staphylococcus aureus (nuc), Vibrio vulnificus (vvh) 그리고 Yersinia enterocolitica (16S rRNA)를 포함한 총 13 종의 개별적인 피크를 분리하였고 혼합된 하나의 시료에서 동시 검출하였다. 또한 우유, 슬라이스 햄, 간 소고기에 인위적으로 13 종의 균을 접종하여 분석한 결과 추가적인 증균 배양의 과정 없이 V. vulnificus를 제외한 나머지 12 종의 균을 동시에 검출 할 수 있었다. 본 기술은 식품 적용에 있어서 최적화 하기 위한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료되나 MLPA-CE-SSCP 기술을 이용한 식중독 세균의 동시 진단법은 식품 안전 분야에서 식중독의 조기 진단 시스템으로 효과적으로 활용될 수 있을 것이다.;Capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism (CE-SSCP) coupled with multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) can be used to rapidly and precisely detect pathogenic bacteria. With food-borne diseases encompass a wide range of illnesses and they have emerged as a growing public health and economic problem worldwide, the rapid and sensitive diagnosis of food-borne pathogenic bacteria is very important to prevent and control of food-borne diseases. In order to protect consumers from the food-borne diseases, the development of rapid and sensitive bacterial detection techniques should be prioritized. A total of 13 bacterial strains were detected simultaneously by MLPA-CE-SSCP analysis with probes that targeted species-specific gene in a single reaction. MLPA amplification probes of the groEL (heat shock protein), glyA (serine hydroxymethyltransferase), hipO (hippuricase), plc (phospholipase C), MMS (macromolecular synthesis), tuf (encoding EF-tu), eaeA (E. coli attachment effacement), hly (listeriolysin O), inv (invasion protein), ipaH (invasion plasmid antigen), nuc (thermostable nuclease), vvh (V. vulnificus hemolysin), and 16S rRNA genes were target to allow accurate and simultaneous detection of Bacillus cereus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Cronobacter sakazakii, Enterococcus spp., Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococcus aureus, Vibrio vulnificus, and Yersinia enterocolitica, respectively. Under this standard assay system, level of detection for MLPA-CE-SSCP analysis was as low as 10 to 100 pg of genomic DNA per μl. Twelve species were detected from food samples including milk, sliced ham, and minced meat artificially inoculated with 13 food-borne pathogens, however, V. vulnificus was not detected in all samples. Although further study for optimization in the food samples is required, overall, the developed detection system of 13-plex food-borne pathogens using high-resolution CE-SSCP coupled with stuffer-free MLPA could be applied to food industry as a suitable early warning system for outbreaks of food-borne diseases.