Three Dimensional Culture of Adipose-tissue Derived Stem Cells in Polypeptide-based Thermogels

Abstract

The poly(ethylene glycol)-poly(L-alanine) (PEG-L-PA) diblock copolymers undergoing sol-to-gel transition as the temperature increased were synthesized to compare their delicate differences in thermosensitive behavior and potential application for 3D culture of adipose-derived stem cells. The molecular weight of L-PA varied over 620, 1100, and 2480 Daltons at a fixed molecular weight of PEG at 5000 Daltons. The UV-VIS spectroscopy, dynamic light scattering, transmission electron microscopy suggested that PEG-L-PAs form micelles with a 10-50 nm in diameter in water with hydrophobic L-PA core and hydrophilic PEG shell. Similar to poly(ethylene glycol)-poly(propylene glycol)-poly(ethylene glycol) triblock copolymers (Pluronics), the PEG-L-PAs underwent unimer-to-micelle transition as the temperature increased in a temperature range of 5-60 oC. Circular dichroism spectroscopy suggested that L-PA of PEG-L-PA form α-helical secondary structure and the mean residue ellipticity of alanine of PEG-L-PA varied depending on the molecular weight of L-PA. In addition, the α-helical secondary structure of L-PA of PEG-L-PA (5000-620) preserved over the 5-60 oC, whereas that of PEG-L-PA (500-2480) turned into random coils as the temperature increased. 13C-NMR spectroscopy suggested that PEG decrease its molecular motion as the temperature increases. 3D culture systems of ADSCs were compared in the PEG-L-PA hydrogels with a similar gel modulus of 600-1000 Pa which was produced by increasing the temperature of cell-suspended aqueous solutions to 37 oC. Even though the cell proliferation was comparable for the PEG-L-PA and MatrigelTM, the ADSCs kept their spherical morphology in the PEG-L-PA hydrogel while they underwent spherical-to-fibroblastic morphological changes in the MatrigelTM. In particular, ADSC showed significantly higher expression of type II collagen, type III β-tubulin, and myogenic differentiation factor 1 in the PEG-L-PA than MatrigelTM, suggesting that the ADSC/PEG-L-PA is promising system for chondrogenic, neurogenic, and myogenic differentiation of the ADSCs.;본 연구에서는 온도가 증가함에 따라 졸-젤 전이를 보이는 이중 블록 공중합체인 폴리(에틸렌 글라이콜)-L-폴리알라닌의 폴리 알라닌 분자량을 다르게 하여 세 가지 고분자를 합성하고 이들의 특성을 비교하였다. 또한 그의 잠재적인 응용으로 지방유래 줄기세포를 3차원으로 배양하여 줄기세포의 증식과 분화에 어떠한 영향을 주는지 연구하였다. 폴리(에틸렌 글라이콜)의 분자량은 5000달톤으로 고정하고 L-폴리알라닌의 분자량은 620, 1100, 2480 달톤으로 조절하였다. 이 세 가지 고분자는 온도가 증가함에 따라 졸-젤 전이를 보인다. 수용액 상에서 고분자는 온도가 증가함에 따라 단일체에서 마이셀로 전이가 일어난다. 친수성인 폴리(에틸렌 글리콜) 쉘과 소수성인 L-폴리알라닌 코어로 마이셀을 형성한다. L-폴리알라닌의 분자량이 클수록 마이셀의 크기가 작다. L-폴리알라닌은 이차 구조로 알파 헬릭스 구조를 가진다. L-폴리알라닌의 길이가 길수록 온도가 증가함에 따라 이차 구조의 변화가 크다. 또한 온도가 증가함에 따라 폴리(에틸렌 글리콜)의 분자 운동이 감소한다. 비슷한 젤의 강도를 갖는 세 가지 폴리(에틸렌 글리콜)-L-폴리알라닌 수화젤에서 지방유래 줄기세포를 3차원으로 배양하였다. 폴리(에틸렌 글리콜)-L-폴리알라닌 수화젤에서는 동그란 모양을 유지하는 반면, 메트리젤에서 자란 지방유래 줄기세포는 시간이 지날수록 동그란 모양에서 섬유처럼 뻗어나가는 모양으로 변한다. 특히 고분자 수화젤에서 연골형성, 신경형성, 근육형성으로 분화가 가능한 것을 관찰할 수 있다. 이는 온도민감성 수화젤이 지방유래 줄기세포의 3차원 배양을 위한 조직공학적 시스템으로써의 가능성을 보여주는 결과이다.