BTNL9, a Butyrophilin-Like Molecule, is a negative regulator of T cell activation

Abstract

Butyrophilin (BTN)과 butyrophilin-like (BTNL) 단백질군은 B7 단백질군과 구조적인 유사성을 가진다. 이들은 세포 바깥쪽으로 immunoglobulin domain을 가지고 세포질 쪽으로는 B30.2 (PRY/SPRY) domain을 가지는 제 1형 막단백질이다. 최근 몇 편의 연구결과에서는 BTN/BTNL 단백질군에 속하는 BTNL2, BTN1A1 그리고 BTN2A2가 활성화된 T 임파구 표면에 발현되는 리간드에 결합함으로써 T 임파구의 활성을 억제함이 보고되었다. 나는 본 학위 논문의 제 1장에서 BTN/BTNL 단백질군에 속하는 또 다른 단백질인 BTNL9 또한 T 임파구의 활성을 저해하는 negative regulator임을 규명하였다. 나는 Btnl9의 mRNA가 thymus, spleen, lymph nodes와 같은 면역 기관들을 포함하는 다양한 조직에서 발현됨을 확인하였고, 면역세포 중에서는 naïve 상태의 T 임파구, B 임파구, macrophage, dendritic cell 에서 발현되는 것을 확인하였다. 반면, BTNL9의 리간드의 발현은 naïve T 임파구가 아닌 활성화된 T 임파구, T helper 1, T helper 2 effector 임파구에서 높았다. 이를 통해 나는 BTNL9과 BTNL9의 리간드가 effector T 임파구의 기능 또는 T 임파구의 활성 조절에 작용할 것이라고 예측하였다. BTNL9의 리간드는 B 임파구, macrophage, dendritic cell 등의 항원제시세포에서도 발현되었으며, 항원제시세포에서의 BTNL9 리간드 발현은 세포의 활성 상태와는 크게 관계가 없었다. 나는 BTNL9의 기능을 연구하기 위해 BTNL9의 세포 바깥쪽 부분과 인간 IgG1의 Fc 부분을 융합시킨 BTNL9-Fc 융합단백질을 발현, 정제하였으며, 이 융합단백질이 T 임파구가 활성화 되는 과정에서 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. BTNL9-Fc 융합단백질을 처리하면 anti-CD3 항체에 의한 T 임파구의 증식과 IL-2, IFN-γ와 같은 cytokine 생성이 현저하게 저해되었으며, T 임파구의 세포사멸은 증가하였다. 또한 BTNL9-Fc 융합단백질을 처리하면 TCR 자극에 의한 Erk/MAPK의 활성, NFAT와 NF-κB 신호전달이 억제되었으며, 같은 맥락에서 CD69와 CD44와 같은 세포표면 활성 마커의 발현 또한 감소되었다. Anti-CD3 항체에 의한 T 임파구의 활성뿐만 아니라 in vitro상에서의 항원 특이적인 T 임파구의 활성과 in vivo상에서의 단백질 항원에 대한 면역 반응 또한 BTNL9-Fc 융합단백질 처리에 의해 감소되었다. 게다가 실험적 자가면역 뇌수막염 (experimental autoimmune encephalomyelitis) 질병모델에서 생쥐에게 BTNL9-Fc 융합단백질을 처리하면 질병의 발병 시기를 늦추고 병세를 약화시킴을 확인하였다. 나는 이러한 결과들을 토대로 BTNL9이 T 임파구의 활성과 면역 반응을 저해하는 negative regulator임을 규명하였다. 제 2장에서는 BTB-ZF (BTB domain-containing zinc finger) 단백질군에 속하는 BZEL (BTB-ZF protein expressed in effector lymphocytes)이라는 단백질의 기능을 B 임파구에서 연구하였다. 본 연구실에서 수행된 이 전 실험 결과에 따르면 BZEL은 T 임파구와 B 임파구가 활성화되면 발현되며 DNA 서열을 특이적으로 인지하여 Blimp1과 p53의 전사를 억제하는 corepressor로서 작용한다고 생각된다. 또한 이 전 실험 결과를 토대로 BZEL은 B 임파구에서 somatic hypermutation (SHM)과 class switch recombination (CSR)에 중요한 역할을 할 것이라고 생각되고 있다. SHM과 CSR은 모두 DNA 손상과 그의 복구가 수반되는 과정이며, SHM 과정 중에 error-free DNA polymerase를 error-prone DNA polymerase로 교체함으로써 SHM 과정에 중요한 역할을 하는 PCNA가 BZEL과 결합함을 이 전에 규명한 바가 있기 때문에, 나는 본 학위 논문의 제 2장에서 BZEL이 DNA damage response (DDR)에 관련이 있는지 확인하고자 하였다. 이러한 가능성을 확인하기 위해 BZEL을 발현하는 유전자가 제거된 DT40 세포주의 성장을 분석해 본 결과, BZEL이 발현되지 않으면 세포의 증식 속도가 감소하고 초기 단계의 세포사멸이 증가함을 확인하였다. 그리고 BZEL이 발현되지 않는 DT40 세포주는 정상 세포주에 비해 과산화수소 처리, 자외선 조사, 감마선 조사 등과 같은 DNA 손상 유발 요인에 더 민감함을 확인하였다. BZEL이 평상시보다 DNA 손상이 유발되는 상황에서 monoubiquitination된 PCNA와 더 많이 결합하는 것으로 보아 BZEL은 monoubiquitination된 PCNA와 결합함으로써 DNA damage response에 관여할 것으로 예측된다. 반면에 germinal center (GC) reaction 단계에서 BZEL이 작용하는 기작을 알아보기 위해 GC 단계에서 유래된 세포주인 Raji B 세포주 내에서 BZEL과 결합하는 단백질들을 IP/MS 방법을 통해 스크리닝 하였다. 실험 결과, BZEL은 BRG1, CHD3, CHD4, MTA2, HDAC2, TIP49b를 포함하는 ATP-dependent chromatin remodeling 복합체들, 그리고 transcriptional corepressor인 KAP1과 같은 DNA damage response 관련 단백질들과 결합함을 확인하였고, 특히 이러한 결합은 BZEL의 post-translational modification에 의해 조절됨을 확인하였다. 또한 이러한 결합은 CH12F3-2A 세포주에서 CSR을 유도했을 경우 감소함을 확인하였다. 이러한 결과들을 통해 나는 BZEL이 DNA damage response에 관여함을 규명하였으며, 이는 특히 B 임파구에서 BZEL이 B cell receptor (BCR)의 다양성을 획득하기 위한 SHM과 CSR 과정에서 기능하는 기작일 것이라고 제시하였다.;Butyrophilin (BTN) and butyrophilin-like (BTNL) family members are a group of proteins that have homology to the B7 costimulatory molecules. They are type I transmembrane proteins with extracellular immunoglobulin domains and some of them have an intracellular B30.2 (PRY/SPRY) domain. Recent studies revealed that mouse BTNL2, BTN1A1 and BTN2A2 can bind to their ligands on the surface of T cells and inhibit T cell activation. In this research, I demonstrate that BTNL9 also functions as a negative regulator of T cell activation. Btnl9 transcripts are detected in several tissues including lymphoid organs such as thymus, spleen and lymph nodes. Among immune cells, Btnl9 transcripts are expressed in cells at resting stage, such as naïve T cells, B cells, acrophages and dendritic cells. On the other hand, BTNL9 ligand expression was found on activated T cells, Th1 and Th2 effector cells, but not on naïve T cells suggesting that BTNL9 and BTNL9 ligand may involved in the regulation of the effector function of T cells or the activation of T cells. BTNL9 ligand was also expressed on B cells, macrophages and dendritic cells regardless of activation stage. To investigate the function of BTNL9, I purified BTNL9-Fc fusion protein in which the extracellular region of BTNL9 was fused to Fc region of human IgG1 and examined the effect of BTNL9-Fc on T cell activation. BTNL9-Fc treatment inhibited anti-CD3 stimulation-dependent T cell proliferation and cytokine production, such as IL-2 and IFN-γ. Consistently, BTNL9-Fc suppressed TCR stimulation-dependent Erk/MAPK activation, and NFAT and NF-κB signaling pathways. In addition, TCR-induced expression of cell surface activation markers, such as CD69 and CD44, was inhibited by BTNL9-Fc treatment. Importantly, BTNL9-Fc inhibited antigen-specific T cell activation in vitro and immune response to protein antigen in vivo. Furthermore, BTNL9-Fc treatment resulted in the delayed onset and the reduced clinical score in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) disease model. These results show that BTNL9 acts as a negative regulator of TCR-dependent T cell activation and subsequent immune response. BZEL (BTB-ZF protein expressed in effector lymphocytes) is a member of BTB-ZF (BTB domain-containing zinc finger) protein family. BZEL protein expression is induced in T/B lymphocytes upon activation and in effector lymphocytes. Previously, it was shown that BZEL acts as a transcriptional repressor of Blimp1 and p53. Additionally, previous studies show that BZEL seems to play a role during somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR) in B cells. Since SHM and CSR trigger DNA damage and subsequent repair processes and BZEL interacts with PCNA involved in SHM by recruiting error-prone DNA polymerase during repair process, I was interested in the possibility that BZEL is involved in DNA damage response (DDR). To study possible functions of BZEL in DDR, I analyzed the proliferation of BZEL-deficient DT40 B cell line and found that BZEL deficiency decreased the rate of cell expansion and increased the proportion of early apoptotic cells. And BZEL-deficient DT40 B cells were more sensitive to various DNA damaging agents, such as H2O2, UV-irradiation and γ-irradiation. Moreover, BZEL interacted with monoubiquitinated PCNA in response to DNA damage suggesting that BZEL may be involved in DNA damage-induced lesion bypass. On the other hand, to determine the mechanism of action of BZEL during germinal center (GC) reaction, I screened for the BZEL binding proteins in GC-derived Raji B cell line by immunoprecipitation and mass spectrometric analysis (IP/MS). I identified that BZEL interacts with various DDR-related proteins including several components of the ATP-dependent chromatin remodeling complexes such as BRG1, CHD3, CHD4, MTA2, HDAC2 and TIP49b, and transcriptional corepressor KAP1. Moreover, interactions between BZEL and its binding proteins seem to be regulated by post-translational modification of BZEL. Particularly, these interactions are regulated by CSR-inducing signal in CH12F3-2A cell line. Taken together, these results suggest that BZEL might be involved in DDR and have a crucial role in generation of B cell receptor (BCR) diversity by SHM and CSR.