The Effects of β-carotene on Inhibition of Cancer Stemness in Neuroblastoma Cells

Abstract

Neuroblastoma(NB) is a commonly diagnosed pediatric tumor of the somatic nervous system. A growing body of evidence suggests that cancer stem cells (CSCs) are a small subpopulation of cancer cells that can self-renew and undergo differentiation into multiple lineages. These cells are considered as the driving force of tumorigenesis, and they are reported to have resistance to conventional chemotherapy. β-carotene (BC) is a well known carotenoid that exerts chemopreventive effects on cancer through antioxidative mechanisms. It is also a precursor of retinoic acid (RA) which is a widely known differentiation inducer. Despite the similarity in chemical structure, the effects of BC on inducing differentiation of cells that have CSC characteristics are not fully understood yet. The aim of this study was to investigate the effects of BC on inhibiting the cancer stemness of malignant NB cells by inducing differentiation and inhibiting self-renewal capacity. When NB cells were treated with various doses of BC, cell viability dramatically decreased in a dose-/time-dependent manner. BC treatment induced neuronal differentiation and increased the expression of a neuronal differentiation marker, β-tubulin III. Furthermore, phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases (ERK) were also increased, which demonstrated that mitogen activated protein kinase (MAPK) signaling pathway was involved in the differentiation process. Colony and sphere formation assays showed that NB cells lost their self-renewal capacity under the treatment of BC, and protein expressions of well-known stem cell markers such as Notch1 and Sox2 were also decreased. BC down-regulated the expression of Drosophila delta-like 1 homolog (DLK1) which maintained the undifferentiated state of malignant NB cells. Furthermore, treatment of BC further inhibited the cancer stemness of NB cells in combination of DLK1 knockdown via small interfering RNA. Moreover, treatment of cisplatin together with BC was more effective in reducing both cell viability and sphere formation when compared to treatment of cisplatin or BC alone, which indicated that BC sensitized NB cells to cisplatin. Taken together, the present study demonstrated that BC inhibited cancer stemness of malignant NB cells and induced differentiation, which suggested that targeting CSC characteristics could be a new anti-cancer mechanism of BC as a potent chemotherapeutic agent.;본 연구에서는 베타카로틴이 신경모세포종의 암줄기세포적 성격에 미치는 영향을 세포분화와 자가복제 기전에 초점을 맞추어 알아보았다. 신경모세포종은 1세 이하의 어린이에게 발병하는 가장 흔한 암 중 하나로써 자율신경계를 구성하게 되는 신경관세포들에서 발생하는 암이다. 암줄기세포란 암세포의 부분 집단으로써 그 수는 매우 적지만 암의 생성 및 유지에 가장 기여하고 있는 악성 세포 집단이다. 이들은 자가복제를 할 수 있고 다른 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력이 있으며 현재 항암치료에 사용되는 약물들에 대해 내성을 갖고 있다. 이 세포들은 분화를 함에 따라 세포 증식 속도가 느려지고 약물에 대해서도 더욱 민감하게 반응하게 되는 등 그 성격이 점차 양성으로 변화한다. 베타카로틴은 카로티노이드의 한 종류로써, 항암효과가 있는 것으로 잘 알려져 있는 항상화 물질이다. 또한 베타카로틴은 비타민 A의 유도체인 레티노산의 전구체이기도 한데, 레티노산은 신경모세포종을 비롯한 다양한 악성 종양의 세포 분화를 유도할 수 있는 물질로 잘 알려져 있다. 베타카로틴과 레티노산의 화학적 구조가 매우 비슷함에도 불구하고 베타카로틴의 세포분화 유도 효과에 대해서는 아직까지 많이 연구되어있지 않다. 그러므로 본 연구에서는 베타카로틴의 세포분화 유도 효과를 신경모세포종의 세포들 가운데 가장 암줄기세포적 성격이 강한 세포들에 대하여 실험함으로써 그 기전을 밝히고자 하였다. 그 결과, 베타카로틴은 악성 신경모세포종 세포들의 신경세포적 분화를 유도함으로써 생존율을 낮추었고, 베타카로틴의 처리 농도가 증가함에 따라 신경세포 분화 지표인 β-tubulin III의 발현과 ERK 단백질의 인산화가 함께 증가하는 것으로 나타났다. 특히 ERK 단백질의 인산화 증가는 베타카로틴으로부터 유도된 신경세포적 분화가 MAPK 신호전달체계를 통해 세포에게 전달된다는 사실을 알려주었다. 뿐만 아니라 베타카로틴은 신경모세포종의 자가복제를 억제하는 성질이 있었는데, 베타카로틴을 처리한 세포들이 통제 집단의 세포들에 비해 적은 수의 colony 및 sphere를 형성하였고, 일반 줄기세포에서도 발현이 높은 것으로 알려져 있는 줄기세포 지표인 Notch1과 Sox2 단백질의 발현도 베타카로틴을 처리한 세포들에서 감소하였다. 베타카로틴은 신경모세포종의 암 줄기세포적 성격을 유지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있는 DLK1의 발현을 억제하였고, siRNA를 이용해서 DLK1을 knockdown하였을 때 베타카로틴을 함께 처리한 세포들이 형성한 colony 수가 가장 많이 감소하였다. 베타카로틴은 악성 신경모세포종 세포들이 현재 신경모세포종 치료에 흔하게 쓰이는 약물인 cisplatin에 대해 기존에 갖고 있던 저항성을 낮추는 데에도 효과가 있었다. 베타카로틴을 저농도의 cisplatin과 함께 처리한 세포들은 두 가지 중 하나만 처리한 세포들에 비해 생존율과 자가복제능력이 떨어진다는 사실을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구는 베타카로틴이 신경세포적 분화의 유도를 통해 악성 신경모세포종의 암줄기세포적 성격을 억제하는 효과가 있다는 사실을 밝혀냈다. 이와 같은 베타카로틴의 효능은 종래에 알려져 있던 베타카로틴의 항암 효과인 항산화와는 다른 새로운 기전으로써, 악성 신경모세포종과 같이 암줄기세포적 성격이 강한 세포들을 제거해야 하는 종양들의 치료법 개발에 유용하게 쓰일 수 있을 것이다.