Functional Characterization on novel isoforms of Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1 in cancer cells

Abstract

Ubiquitin C-terminal hydrolase-L1, UCH-L1, is a deubiquitinating enzyme that catalyzes hydrolysis of ubiquitin ester and amides mainly in neuronal cells. Recently it was reported as a marker that has a potential role in carcinogenesis and neurodegenerative diseases. However, the molecular mechanism of biological function of UCH-L1 was poorly understood. We found that UCH-L1 is highly expressed in non-small cell lung cancer cell line NCI-H157 having high invasion potential, and showed that the expression of UCH-L1 in tumor cells promotes their invasion potentials in vitro and in vivo. Previous studies in our laboratory by Nam (2002) and Kim (2007), identified endogenous existence of a novel N-terminal truncated form of UCH-L1 in NCI-H157 cells and SH-SY5Y cells. N-terminal truncated Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1 (NT-UCH-L1), N-terminal 11 amino acid truncate, has quite different properties from UCH-L1. NT-UCH-L1 has no hydrolytic enzymatic activity because of the loss of N-terminal holding ubiquitin substrate and highly monoubiquitinated in vivo. Monoubiquitination sites of NT-UCH-L1 were identified at K4 and K146 by structural modeling and mass spectrometry analysis. Monoubiquitinated NT-UCH-L1 is heavily localized in the nucleus and mutant NT-UCH-L1 K4/146R is not localized in the nucleus. To characterize a biological function of novel NT-UCH-L1, the post-translational modifications by mass spectrometry and interacting proteins using immunoprecipiation were identified. Since monoubiquitinated NT-UCH-L1 is localized in nucleus, the gene expression profiles of NCI-H157 stable cells generated by overexpressing UCH-L1, NT-UCH-L1, and the mutant NT-UCH-L1 K4/146R were examined. Microarray assay and proteomic analysis using 2D-gel electrophoresis were performed to figure out the different function of NT-UCH-L1 from UCH-L1. Major down regulated genes in NT-UCH-L1 overexpressing NCI-H157 stable cells were identified by microarray analyse as IL6, CCL5, BIRC3 and GRP78. Major down regulated proteins were identified by 2D-gel electrophoresis as vimentin and GRP78. These genes are regulated by several transcription factors. Among them, NF-κB and AP-1 are overlapped. These transcription factors are connected with lots of signaling cascades and responsible for lots of physiological phenomena. To elucidate whether NT-UCH-L1 and the mutant NT-UCH-L1 K4/146R inhibit the transcription factor NF-κB, we measured the transcription activity in NCI-H157 stable cells expressing each NT-UCH-L1 form. Both NT-UCH-L1 and mutant NT-UCH-L1 K4/146R interacted with NF-κB and significantly inhibited its transcriptional activity without discernable differences. It was concluded that NT-UCH-L1 and the mutant NT-UCH-L1 K4/146R have similar inhibitory effect on NF-κB in the cytosol regardless of monoubiquitination. To figure out the function of nuclear monoubiquitinated NT-UCH-L1 and mutant NT-UCH-L1 K4/146R, microarray and proteomic analyse in NCI-H157 stable cells were carried out. However, the mutant NT-UCH-L1 K4/146R does not have any significant difference in gene and protein expression compared with NT-UCH-L1. These results implicate that the monoubiquitination of NT-UCH-L1 is not a cause of regulatio but the result from a certain regulation. Or monoubiquitinated NT-UCH-L1 does not important in lung cancer cell lines, but does in other cell lines. Because HeLa cell does not have endogenous UCH-L1, overexpressed NT-UCH-L1 isn’t affected by endogenous UCH-L1. To confirm results from NCI-H157 cells and to find out whether NT-UCH-L1 and mutant NT-UCH-L1 K4/146R have a different function in other cell lines, we screened the NF-κB pathway in HeLa stable cells expressing NT-UCH-L1. Different from NCI-H157 cells, the IκBα degradation is suppressed in HeLa stable cells expressing NT-UCH-L1. To figure out whether another inhibitory mechanism on NF-κB exists compared with NCI-H157 cells, we performed microarray analysis in HeLa stable cells expressing UCH-L1, NT-UCH-L1 and the mutant NT-UCH-L1 K4/146R. The results were little different from NCI-H157 cells’, but (1) NF-κB target genes were down-regulated in NT-UCH-L1 overexpressed HeLa stable cells also, and (2) NF-κB target genes were down-regulated not only in NT-UCH-L1 overexpressed HeLa stable cells but also in UCH-L1 overexpressed HeLa stable cells, and (3) HeLa stable cells expressing mutant NT-UCH-L1 K4/146R showed some differences in gene expression compared with HeLa stable cells expressing NT-UCH-L1. These results implicate the existence of cell-type specific NF-κB inhibition. Especially, DUSP1, a MAPK phosphatase, is up-regulated in HeLa stable cells expressing NT-UCH-L1 different from NCI-H157 stable cells expressing NT-UCH-L1. These results demonstrate that NT-UCH-L1 significantly inhibits the activation of NF-κB but cellular functions of monoubiquitination of NT-UCH-L1 should be further studied.;UCH-L1은 신경 세포에 주로 존재하는, ubiquitin ester와 amide를 가수 분해하는 탈ubiquitin 효소로서, 신경 퇴행성 질환과 암 발생에 중요한 역할을 하는 marker 로서 알려져 있다. 그러나 그 생물학적 기능의 분자적 기작은 잘 알려져 있지 않다. 본 실험실의 이전의 연구에서, 전이능이 높은 비소세포성 폐암 세포인 NCI-H157 세포주에서 UCH-L1이 과발현 되어있는 것을 발견하고 암세포에서 UCH-L1의 발현량이 그 전이능을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 또한, NCI-H157 세포주와 신경아세포종 SH-SY5Y 세포주에서 UCH-L1의 N-terminal이 잘린 새로운 이성질체를 발견하였다. N-terminal truncated UCH-L1 (NT-UCH-L1)은 UCH-L1의 N-terminal의 11개 아미노산이 잘린 형태로서 UCH-L1과는 다른 성질을 지녔다. 기질 ubiquitin을 붙잡는 N-terminal의 손실로 인해 NT-UCH-L1은 가수 분해 효소의 활성이 없고, 세포 내에서 monoubiquitination된다. 구조 분석과 질량 분석 기술을 이용하여, NT-UCH-L1이 lysine 4번과 146번 잔기에서 monoubiquitination된다는 것을 확인하였다. Monoubiquitination된 NT-UCH-L1은 핵으로 이동하고, 4번과 146번 lysine을 arginine으로 치환시킨 mutant NT-UCH-L1 K4/146R은 핵으로 이동하지 못한다. NT-UCH-L1의 생물학적 기능을 알아보기 위하여, 질량 분석 기술을 이용하여 post-translational modification (PTM) 을, immunoprecipitation 기술을 이용하여 상호 작용하는 단백질을 알아보았다. Monoubiquitination된 NT-UCH-L1이 핵으로 이동하므로, NCI-H157 세포주에 각각 UCH-L1, NT-UCH-L1, mutant NT-UCH-L1 K4/146R을 과발현 시킨 세포에서 유전자 발현의 변화를 살펴보았다. Microarray 실험과 proteomics 분석 기술이 이용되었다. Microarray 실험 결과에서는 IL6, CCL5, BIRC3, GRP78이, 2D-gel electrophoresis에서는 GRP78과 vimentin이 NT-UCH-L1을 과발현시킨 NCI-H157 세포주에서 그 발현량이 감소되었다. 이 유전자들은 몇 가지 전사 인자들에 의해 발현이 조절되는데, 공통적인 것은 NF-κB와 AP-1이다. NT-UCH-L1과 mutant NT-UCH-L1 K4/146R이 NF-κB를 저해하는지 확인하기 위해, 각각을 과발현시킨 NCI-H157 세포주에서 전사 활성을 측정하였다. NT-UCH-L1과 mutant NT-UCH-L1 K4/146R은 서로 큰 차이 없이 모두, NF-κB와 상호 작용하여 그것의 전사 활성을 저해하였다. NT-UCH-L1과 mutant NT-UCH-L1 K4/146R이 monoubiquitination과 무관하게, 세포질에서 NF-κB에 비슷한 저해 작용을 가진다고 확인하였다. Monouibiquitination된 핵 안의 NT-UCH-L1과 mutant NT-UCH-L1 K4/146R의 기능을 알아보기 위해, microarray 실험과 proteomics 분석 실험이 NT-UCH-L1과 mutant NT-UCH-L1 K4/146R을 각각 과발현시킨 NCI-H157 세포주에서 수행되었다. 그러나 mutant NT-UCH-L1 K4/146R은 NT-UCH-L1과 비교하여 유전자 또는 단백질 발현에 차이를 보이지 않았다. 이것은, NT-UCH-L1의 monoubiqutination이 어떤 조절 기작의 원인이 아니라, 결과적인 현상일수도 있다는 것을 암시한다. 아니면, monoubiquitination된 NT-UCH-L1이 폐암 세포주가 아닌 다른 세포주에서 중요성을 가지는 것일지도 모른다. HeLa 세포주는 내생적인 UCH-L1이 없기 때문에 과발현시킨 NT-UCH-L1이 내부의 UCH-L1에 의해 영향을 받지 않는다. NCI-H157 세포주에서의 결과를 확인하고, 다른 세포주에서는 NT-UCH-L1과 mutant NT-UCH-L1 K4/146R이 다른 기능을 가지는지 알아보기 위해서 UCH-L1, NT-UCH-L1, mutant NT-UCH-L1 K4/146R을 각각 과발현시킨 HeLa 세포주에서 microarray 실험을 수행하였다. 결과는 NCI-H157 세포주와 약간 달랐지만, (1) NF-κB에 의해 전사가 조절되는 유전자들은 NT-UCH-L1이 과발현된 HeLa 세포주에서도 역시 발현이 감소되었고, (2) NF-κB에 의해 전사가 조절되는 유전자들은 NT-UCH-L1이 과발현된 HeLa 세포주에서뿐만 아니라 UCH-L1이 과발현된 HeLa 세포주에서도 역시 발현이 감소되었고, (3) mutant NT-UCH-L1 K4/146R을 과발현시킨 HeLa 세포주는 NT-UCH-L1을 과발현시킨 HeLa 세포주와 비교하여 유전자 발현에 약간의 차이를 보였다. 이러한 결과들은 세포 특이적인 NF-κB 저해 기작을 암시한다. 특히, NCI-H157 세포주와는 다르게, MAPK 탈인산화효소인 DUSP1이 NT-UCH-L1이 과발현된 HeLa 세포주에서 증가되었다. 이러한 결과들을 통해서, NT-UCH-L1이 NF-κB의 활성을 저해한다는 것을 확인하였지만, NT-UCH-L1의 monoubiquitination이 갖는 세포 내 역할은 앞으로 더 연구되어야 한다.