미립자 응집반응을 이용한 융모성 성선 자극홀몬(hCG)의 면역 측정법에 관한 연구

Abstract

초기 임산부의 임신여부를 판별하는 진단 표지물질로서 융모성 성선자극 홀몬(human choriogonadotropin, hCG)이 이용되고 있으며, 본 연구에서는 미립자(microparticle)의 응집반응을 이용한 hCG 면역분석방법을 연구하였다. hCG의 whole molecule(w-hCG)중 β subunit만을 분리 정제하여 토끼에게 면역 주사하여 β subunit에 대한 polyclonal antibody를 생산한 후, affinity chromatography와 DEAE cellulose chromatography에 의해 토끼의 항혈청으로 부터 면역항체(immunoglobulin G, IgG)를 분리하였다. 분리 정제된 IgG와 w-hCG를 이용하여 미립자 응집반응에 의한 3종류의 면역측정법을 확립하였다. 간접 미립자 응집법(indirect agglutination method)의 경우 w-hCG를 0.42 ㎛의 미립자에 결합시키고 여기에 w-hCG에 대한 항혈청과 검뇨를 가하여 응집반응을 관찰하였다. 검뇨에 hCG가 존재하면 미립자에 결합되어 있는 hCG와 함께 항혈청에 대하여 경쟁반응을 일으켜 응집반응을 보이지 않고, 검뇨에 hCG 가 존재하지 않으면 항혈청과 미립자에 결합된 항원이 응집 반응을 일으킨다. 이 방법으로 3분 이내에 1.0 IU/mL이상의 hCG를 검출할 수 있었다. 직접 미립자 응집법(direct agglutination method)의 경우 토끼의 항혈청(anti β-hCG antiserum)에서 분리정제한 IgG를 미립자에 결합시켜 미립자 항원을 만든 후 검뇨와 반응시켰다. 이때 검뇨에 hCG가 존재하면 미립자에 결합된 항체와 응집반응을 보였다. 5.4 ㎍/mL이상의 역가를 지닌 IgG를 미립자에 결합시켜 뇨와 반응을 시켰을 때 3분이내에 2 IU/mL이상의 hCG를 검출할 수 있었다. 최첨단 기법인 dry immunochromatographic method는 착색 미립자에 hCG와 human IgG를 함께 결합시켜 glass fiber membrane 위에 처리하였다. 다른 nitrocellulose membrane에는 hCG hormone과 반응을 일으킬 수 있는 면역항체(anti β-hCG IgG)를 처리하여 result line을 만들고, 미립자의 이동상태를 점검할 수 있도록 human IgG와 반응하는 면역항체(anti human IgG)를 처리하여 control line을 만들었다. 이렇게 만든 immunochromatographic method는 hCG가 함유되어 있는 뇨에서는 하나의 착색선을, hCG가 함유되어 있지 않은 뇨에서는 두개의 착색선을 형성한다. 이 방법으로 분석시간 10분이내에 0.5 IU/mL이상의 hCG를 검출할 수 있었다.;Human choriogonadotropin(hCG) has been widely used as a diagnostic marker in the early testing of pregnancy. In this study, the microparticle-based immunoassays were established for the detection of urinary hCG. Pure β subunits of hCG used as an immunogen were obtained by chromatographic separation for the preparation of polyclonal antibody. Specific immunoglobulin G was isolated from β subunit-immunized antiserum by affinity chromatography or DEAE-cellulose chromatography. The three types of particle-based immunoassays were established. These were the indirect agglutination method, the direct agglutination method, and the dry immunochromatographic method. For the indirect agglutination method, w-hCG was coupled to the microparticles. Anti β-hCG antiserum and sample urine were added to the hCG-coupled microparticles. The agglutination response appeared with the negative urine. The non-agglutination response appeared with the positive urine. In this method, hCG in urine sample and hCG in coupled microparticles competed to the binding site of antibody. The assay sensitivity was 1 IU hCG/mL urine and the assay response time was 2 minutes. For the direct agglutination method, purified IgG from β-hCG antiserum was coupled to the microparticles. The agglutination response appeared with the positive urine sample but the non-agglutination response appeared with the negative urine sample. The agglutination response appeared when the titer of anti β-hCG IgG was 5.4 ㎍/mL or higher. The assay sensitivity was 2 IU hCG/mL urine and the assay response time was 3 minutes. The dry immunochromatographic method is the most advanced method in the field of microparticle-based immunoassay. w-hCG and purified human IgG were coupled to the colored microparticles and sprayed on glass filter membrane. On the other hand, result and control lines were treated on the nitrocellulose membrane. The one colored line appeared with the positive urine and two colored lines with the negative urine. The assay sensitivity was 0.5 IU hCG/mL urine and the assay response was 10 minutes.